作者：刘林,张敏,邹萍,田蕾,刘芳　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，武汉 430022

　　【摘要】为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响，将构建的针对PLK1 mRNA的siRNA真核质粒，导入K562/A02细胞，用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示，与对照组相比，转染24和48小时后，siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1 mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%，蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后，细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后，G2/M期细胞比例提高了2.77倍，同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论： PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长，使细胞周期停滞在G2/M期，同时使得细胞内ADM积累量提高，对ADM敏感性增强。

　　【关键词】 PLK1基因沉默

　　Abstract The study was purposed to investigate the effect of small interference RNA (siRNA) targeting Polo-like kinase 1 (PLK1) gene on cell cycle progression，proliferation and drug resistance in K562/A02 cells.siRNA plasmid vector specifically targeting PLK1 gene with enhanced green fluorescence protein (EGFP) was transfected into K562/A02 cells.Expressions of PLK1 mRNA and protein were assayed by RT-PCR and Western-blot; cell proliferation was evaluated by direct cell counting after trypan blue staining.Cell cycle and intracellular adriamycin(ADM)accumulation was determined by flow cytometry; 50% inhibition concentration (IC50) of ADM on K562/A02 cells was determined by MTT method.The results showed that，as compared with control cells，siRNA plasmid reduced PLK1 mRNA expression by(34.7±2.1)% for 24 hours and by(56.6±1.5)% for 48 hours，PLK1 protein significantly decreased simultaneously by (49.9±3.2)% and by (62.1±1.7)%.After being transfected for 24 and 48 hours，the rate of survival cells decreased by 30% and 59% respectively.Forty-eight hours after transfection，the ratio of K562/A02 cells at G2/M increased by 2.77-fold，at the same time，intracellular ADM accumulation increased and the relative efficiency of K562/A02 cells to ADM was 73.8%.It is concluded that PLK1 gene silence can inhibit K562/A02 cell proliferation，induce cell cycle arrest at G2/M，and increase intracellular ADM accumulation，so that enhance cell sensitivity to ADM.

　　Key words PLK1 gene silence; siRNA plasmid; K562 cell/A02 cell; cell cycle; drug resistance

　　Polo样激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)为polo样激酶家族的成员之一，其基因由于和果蝇Polo基因序列具有高度同源性，且基因编码产物表现为丝氨酸/苏氨酸激酶特性而得名。PLK1主要参与细胞有丝分裂调控：促进cyclin B/Cdc2的激活，协助中心体的功能成熟和双极性纺锤体的形成，调节促后期复合体(anaphase-promoting complex，APC)参与有丝分裂晚期事件，以及影响胞质分裂等[1]。研究发现，PLK1在多种肿瘤细胞中异常高表达，抑制其功能或表达会导致细胞周期停滞并诱导细胞凋亡，推测PLK1可能与肿瘤细胞的增殖、凋亡密切相关[2]。本研究采用小RNA干扰技术抑制K562/A02耐药细胞中PLK1的表达，分析其对细胞周期和增殖的影响，并初步探讨其在逆转细胞耐药方面的可能作用。

　　材料和方法

　　材料

　　细胞系

　　人红白血病细胞系K562为华中科技大学同济医学院免疫室惠赠，经阿霉素诱导产生的耐药细胞系K562/A02购自中国医学科学院血液病研究所。

　　主要试剂 TRIZOL试剂、Lipofactamine 2000和Opti-MEMⅠ购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒、Taq酶和dNTP购自MBI公司;兔抗人PLK1多克隆抗体购自Biolegend公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购自Pierce公司;MTT购自Amresco公司;ADM购自深圳万乐药业有限公司;碘化丙锭(PI)和台盼蓝购自Sigma公司;RPMI 1640和新生牛血清购自Gibco BRL公司;shRNA寡核苷酸序列和PCR引物序列由上海博亚生物有限公司合成。

　　方法

　　细胞培养

　　K562，K562/A02细胞使用RPMI 1640培养液(含有10%新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素)，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。此外，K562/A02需维持培养在含1 μg/ml ADM的培养液中，实验前无药培养2周。

　　质粒构建

　　携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA真核表达载体和针对PLK1 mRNA位点1416-1436(NCBI GenBank 序列号：X75932)的siRNA已由本室成功构建并经测序证实，分别命名为pEGFP-H1(空载体)和pEGFP-PLK1。针对PLK1靶基因的siRNA寡核苷酸具体序列如下：正义链：5’TCCCGCAGTACATAGAGCGTGACGGTCAAGAGCCGTC-ACGCTCTATGTACTGCTT 3’，反义链：5’CAAAAAGCAGTACATAGAGCGTGACGGCTCTTGACCGTCACG-CTCTATGTACTGC 3’。

　　细胞转染

　　将处于对数生长期的K562/A02细胞分为3组：空白对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-PLK1转染组，按Lipofactamine 2000转染说明书转染K562/A02细胞。转染后24和48小时收获细胞进行实验。每组实验重复3次。

　　PLK1 mRNA表达的RT-PCR检测

　　转染后的24和48小时，收集上述3组细胞，以TRIZOL试剂提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后，取1 μl进行PCR反应，以β-actin作为内参照。PLK1的PCR引物序列为：上游引物5'TTCGTGTTCGTGGTGTTGGA 3'，下游引物5'CTCGTCATTAAGCAGCTCGT 3'，扩增产物为563 bp。PCR反应体系20 μl，反应条件：95℃预变性3分钟，95℃ 40秒，58℃ 50秒，72℃ 1分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。取5 μl PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并扫描分析，以PLK1/β-actin条带的光密度比值进行PLK1基因表达水平半定量分析。

　　PLK1蛋白表达的Western-blot检测

　　转染后的24和48小时，收集3组细胞，按参考文献[3]提取细胞胞核蛋白;定量为2 μg/μl，以20微升/泳道点样，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时，转膜至硝酸纤维素滤膜上，经脱脂奶粉封闭过夜后，用1∶500的兔抗人PLK1多克隆抗体孵育1小时;再用1∶7 500的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG孵育1小时，最后经ECL系统曝光显影，通过凝胶分析系统分析蛋白的表达。

　　细胞成活率的台盼蓝拒染试验检测

　　转染后24和48小时，收集3组细胞，用PBS洗2遍后重悬于0.5 ml PBS，用体积分数0.4%的台盼蓝等渗盐溶液与细胞悬液以1∶9的比例混合，1分钟内在相差显微镜下观察，计算出未着色细胞数(即活细胞数)所占细胞总数的百分率，即为细胞的成活率。

　　细胞周期的FACS检测

　　转染后48小时，收集3组细胞，用体积分数70%乙醇-20℃固定过夜，PBS洗2遍后，重悬于0.5 ml PBS，加入 PI 和RNA酶至终浓度分别为10 μg/ml和100 μg/ml，4℃孵育30分钟，上机检测。

　　细胞内阿霉素(ADM)积累量的FACS检测

　　转染后48小时，K562细胞和上述3组细胞调节成1×106/ml的浓度，分别与1 μg/ml的ADM在37℃共同孵育1小时，用预冷的PBS洗2遍后，冰浴以中止ADM的作用，参照文献[4]，经流式细胞仪检测细胞内的ADM稳态积累量。

　　ADM的半数抑制浓度(IC50)的MTT法检测

　　转染后48小时，将K562细胞和上述3组细胞调整为1×104/ml，在96孔板的各孔中加入180 μl的细胞和不同浓度的ADM 20 μl(终浓度为0.01-100 μg /ml);每个浓度设3个平行孔，培养48-72小时;每孔加入MTT(5 mg/ml) 20 μl，继续培养4小时后，加入DMSO 150 μl终止反应，选择570 nm波长测定各孔吸光度值(A值)。细胞的生长抑制率(%)=(1-试验孔A/对照孔A)×100%，根据生长抑制率计算半数抑制浓度(IC50)。相对逆转效率=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)×100%，其中IC50A是K562/A02细胞的IC50，IC50B是转染载体后的K562/A02细胞的IC50，IC50C是K562细胞的IC50。

　　统计学处理

　　数据以均值±标准差( ±SD)表示，采用配对资料t检验、方差分析和q检验，用SPSS 11.5统计学软件处理。

　　结果

　　倒置荧光显微镜下观察K562/A02细胞的转染结果

　　转染后24和48小时，镜下可见大量细胞表达绿色荧光蛋白(图1)。

　　SiRNA抑制K562/A02细胞PLK1基因和蛋白的表达

　　RT-PCR扩增PLK1和β-actin的片段分别位于563 bp和250 bp处。K562/A02细胞转染pEGFP-PLK1 24小时后，PLK1 mRNA的下降(34.7±2.1)%，48小时后下降了(56.6±1.5)%(P<0.05)。空载体转染组PLK1 mRNA表达水平与空白对照组无显著差异(图2)。

　　Western-blot结果与此相似。转染pEGFP-PLK1 24小时后，K562/A02细胞PLK1蛋白表达下降(49.9±3.2)%，48小时后下降到了(62.1±1.7)%(P<0.05)。空载体转染组PLK1蛋白表达水平与空白对照组无显著差异(图3)。

　　SiRNA对细胞存活率的影响

　　台盼蓝染色记数结果见图4。转染后的24和48小时，转染pEGFP-PLK1细胞存活率分别下降了30%和59%，推断siRNA能有效抑制细胞增生。

　　SiRNA对细胞周期的影响

　　转染pEGFP-PLK1 48小时后，FACS检测结果见图5。 K562/A02细胞G0/G1期的比例由60.22%下降为40.85%，G2/M期细胞比例由10.18%上升至28.17%(P<0.05)，且凋亡细胞比例明显增多。空载体转染组变化不明显(表1)。

　　SiRNA对K562/A02细胞内ADM积累的影响

　　转染pEGFP-PLK1 48小时后，FACS检测细胞内ADM结果见图6。转染pEGFP-PLK1质粒组细胞内ADM的平均荧光强度由10.88提高至98.36(P<0.05)，阳性细胞率也由1.66%增加到56.32%(P<0.05)，空载体转染组变化不明显(表2)。Table 2. Effect of siRNA on ADM intracellular accumulation of K562/A02 cells(略)

　　SiRNA对K562/A02细胞对ADM敏感性的影响

　　转染pEGFP-PL K1质粒48小时后的K562/A02细胞对化疗药物ADM的敏感性明显增加，相对逆转效率为73.8%(表3)，而空载体转染组无明显变化，推断转染pEGFP-PLK1质粒可以恢复K562/A02细胞对ADM的敏感性。Table 3. Effect of siRNA on IC50 of ADM of K562/A02 cells(略)

　　讨论

　　PLK1是新近发现的一种细胞周期调控分子，在G2/M期表达且活性最高，主要位于细胞的中心体和分裂期细胞的中体，其表达和活性在有丝分裂指数高的组织和细胞中明显增高，如胚胎、结肠和肿瘤组织[5]。现已发现，PLK1在多种肿瘤细胞中异常高表达，其表达情况可作为预后判断的参考因素之一[6]。有关非小细胞肺癌的研究表明，PLK1的表达与放、化疗的疗效相关，表达水平高者疗效低下且易于耐药[7]，这表明PLK1可能参与肿瘤细胞的耐药机制。

　　本研究将构建的特异性针对PLK1 mRNA的siRNA载体导入K562/A02细胞，结果显示，其在转染后的24和48小时能有效且特异性抑制PLK1的表达，减缓K562/A02细胞的增殖，使细胞周期停滞在G2/M期并诱导细胞凋亡。结果与Liu等[3]的实验的结果类似。与此同时，本研究还发现，在转染后的48小时，抑制PLK1的表达尚能提高K562/A02细胞内ADM的积累量，并能明显恢复细胞对ADM的敏感性。分析其原因可能是，一方面针对PLK1的siRNA间接抑制K562/A02细胞的膜泵功能。Chamberst 等[8]证明，PKC可磷酸化P-gp，而PKC是PLK1的磷酸化底物之一[9]。抑制PLK1的表达可能使得PKC活化受抑，从而影响P-gp的功能，使得细胞内ADM积累量增加，ADM杀伤细胞能力增强。另一方面，抑制PLK1使得K562/A02细胞G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增多，更多细胞进入增殖周期，从而增强细胞对ADM的敏感性。

　　白血病细胞耐药是多基因、多种耐药机制共同作用的结果(如mdr1、LRP、GST和bcl-2等)[10]，使得针对某单一因素的方法常难以奏效。本研究虽是体外实验24和48小时的结果，但仍然显示PLK1基因沉默在逆转细胞耐药方面可能起着重要作用。若能在针对其他耐药基因的基础上，结合本研究的结果，即靶向性地封闭瘤细胞PLK1的表达，将能更有效地逆转肿瘤细胞耐药，为未来肿瘤的治疗提供新的有效途径。

　　【参考文献】

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　　2Eckerdt F，Yuan J，Strebhardt K.Polo-like kinases and oncogenesis.Oncogene，2005; 24: 267-276

　　3Liu X，Erikson RL.Polo-like kinase (Plk)1 depletion induces apoptosis in cancer cells.Proc Natl Acad Sci USA，2003; 100: 5789-57794

　　4何一心，杨少光，张淑靖等.多药耐药性细胞的鉴别和分离.中华血液学杂志，1992;13: 173-175

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　　6Takai N，Hamanaka R，Yoshimatsu J，et al.Polo-like kinases (Plks) and cancer.Oncogene，2005; 24: 287-291

　　7Wolf G，Elez R，Doermer A，et al.Prognostic significance of polo-like kinase (PLK) expression in non-small cell lung cancer.Oncogene，1997; 14: 543-549

　　8Chambers TC，McAvoy EM，Jacobs JW，et al.Protein Kinase C phosphorylates P-glycoprotein in multidrug resistance human KB carcinoma cells.J Biol Chem，1990; 265: 7679-7686

　　9Yokoyama G，Fujii T，Tayama K，et al.PKCdelta and MAPK mediate G(1) arrest induced by PMA in SKBR-3 breast cancer cells.Biochem Biophys Res Commun，2005; 327: 720-726

　　10谭耀红，杨纯正，赵春华等.NF-H 基因参与K562/ A02 细胞多药耐药机制形成的研究.中华肿瘤杂志，2004; 26: 328-332