庞丽　　作者单位：吉林大学第一医院，吉林长春 130021

　　【摘要】目的研究海人藻酸致痫大鼠心肌细胞ERK表达情况。方法 采用立体定位仪下杏仁核内注射海人藻酸方法制备癫痫动物模型，在大鼠癫痫发作后不同时程，快速制备心脏组织标本，进行免疫组化及染色，用Image_Pro Plus图像分析软件，计算大鼠心肌细胞ERK表达灰度值的均数和标准差，观察不同时程心肌细胞ERK表达情况。结果 致癫痫组大鼠心肌细胞ERK表达于癫痫发作后1/2小时开始增加，灰度值为4735.86±172.43，2小时心肌组织ERK的表达达到高峰，灰度值为12764.71±178.45，与对照组相比P值均<0.05，随后逐渐下降;至癫痫发作6小时，心肌组织ERK表达基本消失，灰度值为2389.78±185.64，与对照组相比P>0.05。结论 ERK在癫痫所引起的脑心综合征中有表达。

　　【关键词】 癫痫 心肌细胞 细胞外信号调节激酶

　　[Abstract] Objective To study the ERK expression of myocardial cell in epilepsy rat induced by kainic acid. Methods Rat epilepsy model was prepared by injection of kainic acid into amygdala under three_dimensional positioning devices. At different time points after epilepsy spasm, heart tissue specimens were immediately prepared for immunohistochemistry and staining. Using Image_Pro Plus image analysis software, rat myocytes ERK expression gray value (mean±SD) was calculated. Results Myocardial cells ERK expression (gray value) in epilepsy rat began to increase since 0.5 h after epilepsy spasm (4735.86±172.43). It reached peak at 2 hours after epilepsy spasm (12764.71±178.45). Myocardial tissue ERK expression in epilepsy rat was significantly higher than in control rat (P<0.05), then it decreased gradually; at 6h after spasm, the myocardial tissue ERK expression was as high as before spasm (P>0.05). Conclusion ERK expression was increased in the brain_heart syndrome caused by epilepsy.

　　[Key words] Epilepsia; Myocardial cells; ERK

　　引起脑心综合征的原因很多，颞叶癫痫是最常见之一，但国内关于颅内疾患所致的脑心综合征的报导，少有由癫痫引起脑心综合征的临床报道。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)作为胞内信号转导系统，在海人藻酸(KA)致痫模型中以及在心血管系统中均有重要意义，然而MAPK在癫痫引发脑心综合征中是如何发挥作用，尚无公认的定论。有研究报道，在KA侧脑室内注射致痫模型中，痫性发作1/2h后ERK(细胞外信号调节激酶)、JNK、p38均升高，ERK持续升高约3h，而JNK和p38在2h后即恢复正常[1]，本文对ERK在癫痫所引起的脑心综合征中的表达进行探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器和试剂：动物大脑立体定位仪(BUNKYO_KV113TOKYO)_日本;LMS_2B型二道生理记录仪_成都。MAPK1/2(抗体)及KA购自美国sigma公司。

　　1.2 动物分组：实验动物选用健康雄性Wistar大鼠42只，体重约250克，均购自吉林大学新民校区实验动物部，其中正常对照组大鼠7只，致痫组大鼠35只，按海人藻酸致痫后癫痫发作即刻、1/2小时、2小时、4小时及6小时分为5组，每组各7只。

　　1.3 模型建立：将KA溶解在PBS中性缓冲液中，配制成浓度为1毫克/毫升的液体。用10%水合氯醛0.33ml/kg体重腹腔麻醉大鼠。将大鼠两外耳道固定于立体定位仪上，并将水平线调零。取头颅正中菱形切口，暴露颅骨及前囟、后囟，将立体定位仪正中线调零。右侧杏仁核基底外侧核的坐标位置为前囟后2.5mm，旁开5.0mm，颅骨表面下8.0mm。用小牙钻钻透顶骨至硬脑膜处，一部分动物在KA注射前，预先在左侧海马CA3区包埋双极电极。按照上述右侧杏仁核坐标，注入海仁藻酸1ul，空白组为生理盐水1ul，注药后留针约5min左右，缓慢退出。然后，缝合切口，将大鼠放在敞口有机玻璃罩中，按Racine分级法，将大鼠行为分为以下5级：0级_正常行为状态;I级：湿狗样颤动，面部痉挛抽动，包括眨眼、动须、节律性咀嚼等;Ⅱ级：I级加节律性点头;Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛;Ⅳ级：站立并伴双侧前肢痉挛;Ⅴ级：持续站立、倾倒、失平衡、四肢抽动。达到以下两个条件为模型成功。①按Racine标准分级，大鼠致痫后出现Ⅲ级以上发作;②鼠海马深部电极脑电图出现正常波上棘波和尖波放电。

　　1.4 免疫组化及染色：分别于大鼠癫痫发作后即刻、1/2h、2h、4h及6h后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，快速取心脏标本，置于10%中性缓冲福尔马林固定液中1.5小时后，弃去固定液，准备酒精脱水、石蜡包埋及免疫组化及染色。切片经HE染色后拍照，在显微镜下放大20倍后再拍照，每张切片选取10个视野，选定其中某一细胞作为标准，用Image_Pro Plus图象分析软件测定心肌组织ERK表达的灰度值。

　　1.5 统计学处理：所有实验数据用x-±s表示。统计学分析，各组间比较采用方差分析，成组数据的比较采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 海人藻酸致痫大鼠的海马深部电极脑电改变

　　正常大鼠脑电波形，频率以5～10赫兹为主，波幅小于700Mv，见图1。KA注射后各组大鼠脑电波均出现多种形式的癫痫性放电。典型波形有单棘波、多相棘波、双相棘波、棘慢波、尖波发作性节律波、发作后抑制等，见图2。

　　2.2 致癫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的病理学改变，见图3～7。

　　图2 癫痫发作后大鼠脑电图图3 阴性对照组的大鼠心肌细胞排列整齐，致密，结构清晰，细胞核呈卵圆形，心肌纤维染色呈淡蓝色，ERK表达呈阴性。

　　图4 KA注射致痫后1/2小时图5 KA注射致痫后2小时图6 KA注射致痫后4小时图7 KA注射致痫后6小时

　　2.3 致痫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的灰度值测定：见表1。表1 致痫组与给药组大鼠癫性发作后不同时程心肌组织ERK表达灰度值 注：与对照组比较P<0.05

　　3 讨论

　　心脏和中枢神经系统相互关联，正常情况下脑通过自主神经系统调节心脏活动而维持一种稳态，当神经系统发生病变时会打破这种稳态。

　　MAPK是一个重要的细胞内信号传导酶家族。其成员ERK与细胞生长、增殖、分化及凋亡，甚至保护作用有关。心肌细胞凋亡是心肌细胞的一种程序性细胞死亡，它在心脏的正常发育过程中及心力衰竭、原发性高血压、心律失常等许多心血管疾病的病理生理中起着重要作用[2]。ERK分子所涉及的通路可能通过影响苔藓纤维重组、突触重塑等机制参与癫痫的发病，与心肌细胞的肥厚和凋亡等病理过程也密切相关。已有研究显示，MEK_ERK通路可能对细胞凋亡的过程起到保护作用。PKC作为细胞信号传导系统中一个重要成分，广泛存在于心肌细胞胞浆中，依赖Ca2+激活，参与细胞信息的传递、细胞的增殖、突触的可塑性和基因的表达[3]。另有研究发现，Raf_1_ERK级联反应的上游调控机制因细胞类型和刺激物的不同而有高度差异性，AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用，且AngⅡ激活心肌细胞ERK通过PKC,而不依赖Ras[4]。本实验通过杏仁核内注射KA致痫后的不同时程癫痫大鼠心肌细胞的病理学改变及ERK蛋白表达的变化情况进行研究，结果显示正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，致密，结构清晰，细胞核呈卵圆形，心肌纤维染色呈淡蓝色，无ERK蛋白表达。KA致痫后1/2小时，心肌细胞ERK的磷酸化水平开始增高，于癫痫发作2小时后达高峰，与手术对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)。之后逐渐下降，至6小时左右ERK表达基本消失。分析上述结果的主要原因可能在于：癫痫等神经系统疾病急性发作时，可使机体处于应激状态，促发肾素_血管紧张素醛固酮系统，使循环与局部组织的AngⅡ增高。AngⅡ与细胞膜上的AT1受体结合，产生二酰基甘油和三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网上IP3受体结合，使内质网释放钙增加，二酰基甘油激活蛋白激酶C，引起细胞内Na+-H+交换，促进细胞内外Ca2+-Na+交换，进入细胞内的Ca2+增多，使细胞内钙超载[5]，进而激活PKC信号传导途径。癫痫发作2小时ERK表达达高峰，在此时间段AngⅡ可引起心肌细胞ERK激活发挥短暂的抗凋亡作用，随后逐渐降低，约6小时后，心肌细胞ERK表达基本正常，抗凋亡作用基本消失，继发引起其它致心肌细胞凋亡因素的作用增强，最终引起心肌细胞凋亡。但离体实验证明血管紧张素引起调亡的机制为激活P38激酶与P53蛋白从而引起Bcl_2Bax蛋白比值降低，启动caspase_3，引起钙依赖的DnaseⅠ启动而导致凋亡[6]。总之，ERK在癫痫所引起脑心综合征中有表达，起到短暂的抗凋亡作用，随着时间的推移，AngⅡ最终引起ERK表达减弱，致使其它促凋亡因素的作用增强而引起心肌细胞凋亡，这又与以往AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用等研究结论相一致。

　　【参考文献】

　　[1]刘智良，徐如祥，姚志彬，等.红藻氨酸致痫后大鼠海马ERK、P38MAPK和JNK的活性变化[J].中华神经医学杂志，2006，5(2)：137-144.

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　　[3]Chien KR, Grace AA, Hunter JJ. Molecular biology of cardiac hypertrophy and heart failure. In: Chien KR, ed.Molecular Basis of Cardiovascular Disease[M]. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co, 1998:211-250.

　　[4]House B, Sopart A, Isenberg G. Cyclical mechanical stretch_induced apoptosis in myocytes from young rats but necrosis in myocytes from old rats[J]. Am J Phyaiol Hcart Cire Physiol, 2003,285:H1521-H1527.

　　[5]Wang XF, Gao GD, Yang YB, et al. Identification of up-regulated genes induced by angiotensin Ⅱ in cardiac fibroblasts[J]. Acta Physiol Sin (生理学报), 2005,57(5):643-647.

　　[6]齐丽，张钧华，李大元，等. 血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞调亡[J]. 北京大学学报(医学版)，2002，34(2)：184-186.