郝方元,董万强,刘俊,任乾,张驰　　作者单位：江苏大学生命科学研究院，江苏 镇江 212013

　　【摘要】目的：探讨干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因在鸡体内的表达与功能，为IFITM3的深入研究和禽流感的防治提供有价值的参考。方法：本研究通过搜索鸡的基因组数据获得鸡的IFITM3，使用生物信息学分析方法、荧光定量RT-PCR技术对鸡IFITM3基因的遗传进化、蛋白特性和组织表达分布进行了研究。结果：鸡的IFITM3蛋白序列全长113个氨基酸，含有两个长度相似的跨膜区和一个CD225结构域，二级结构与人的IFITM3相似，但N末端差异较大。S-棕榈酰化修饰对于IFITM3的抗病毒活性起着决定性作用。分析显示，鸡的IFITM3共含有4个潜在的S-棕榈酰化位点，即Cys45/49/53/89，意味着鸡的IFITM3蛋白也具有抗病毒活性。荧光定量RT-PCR结果显示，IFITM3在鸡的各组织表达广泛。在检测的17种组织中，仅血液没有表达。另外，IFITM3在以肺、脾为代表的非消化道组织表达量低，在以十二指肠、盲肠为代表的消化道组织和肝脏组织表达量高。鸡的IFITM3与人的IFITM3组织表达特征相似。 结论：鸡的IFITM3基因对胃肠道免疫和肝脏免疫有重要作用。

　　【关键词】 干扰素诱导跨膜蛋白3; CD225; 荧光定量PCR; 胃肠道免疫; 肝脏免疫; 禽流感; 抗病毒因子

　　[Abstract]　Objective： Investigating the expression and the function of IFITM3 gene of chicken would contribute to further studying for IFITM3， and offer a reference of preventing avian influenza viruses(AIV). Methods： In this study， the coding sequence of chicken IFITM3 was obtained by searching the chicken genome database. Bioinformatics analysis was used to evaluate the genetic evolution and the specificity of IFITM3 protein. Quantitative RT-PCR was used to evaluate the expression of IFITM3 mRNA in various chicken tissues. Results： Chicken IFITM3 protein is predicted to have 113 amino acids. The structure analyses show that it contains two transmembrane regions and one CD225 domain. The secondary structure of chicken IFITM3 is similar to that of human IFITM3. The difference between chicken and human IFITM3 focuses on the N-terminus. S-palmitoylation modification contribute to the antiviral activity of IFITM3. Our analysis showed that chicken IFITM3 contained 4 potential S-palmitoylation sites (Cys45/49/53/89)， suggesting that it may have anti AIV activity. The expressions of IFITM3 in 17 chicken tissues were detected. The results show that IFITM3 was expressed in all analysed tissues except blood. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) revealed that the relative expression levels of chicken IFITM3 in the digestive tissues and the liver were higher than those in non-digestive tissues， such as lung and spleen. The expression pattern of chicken IFITM3 appears to be similar to that of human IFITM3. Conclusion： These results suggest that chicken IFITM3 gene might play an important role in the immunity of the gastrointestinal tract system and the liver.

　　[Key words]　IFITM3; CD225; qRT-PCR; gastrointestinal tract immunity; liver immunity; avian influenza; anti-viral factor

　　在人体内，干扰素诱导跨膜蛋白(interferon induced transmembrane protein，IFITM)基因家族含有4个成员，即 IFITM1(9-27)、IFITM2(1-8D)、IFITM3(1-8U)和IFITM5(bone restricted IFITM-like， BRIL)[1-2]。它们参与体内多项生理活动，包括细胞信号转导、细胞的粘着、肿瘤的形成、生殖细胞的归巢和成熟、骨盐的沉积等[3-6]。目前，除IFITM5蛋白在骨盐沉积中的作用已经确定外[2,7]，其他成员的功能还不完全清楚[8]。最近，Brass等[8]发现IFITM1、2、3对甲型流感病毒的多个亚型(H1、H3、H5及H7)都有很强的抑制作用，其中IFITM3的抑制效果最强。IFITM3的缺失将导致病毒在细胞内的复制速度比一般条件下快5～10倍，这提示IFITM蛋白是一类新的细胞内抗病毒因子。尽管IFITM蛋白抑制病毒复制的机制尚不十分清楚[9]，但它们在抗病毒方面的显著作用已受到广泛关注。

　　到目前为止，IFITM3的相关研究主要集中在人和鼠中，在禽类中还没有相关报道。本文通过搜索鸡的基因组数据，找到IFITM3的同源基因，并利用生物信息学分析方法、组织表达谱分析技术对鸡IFITM3基因的遗传进化、蛋白特性和组织表达分布进行了研究，以期为鸡IFITM3的功能研究和禽流感的防治提供有价值的参考。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂及耗材

　　TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0试剂盒、pMD?19-T Vector、SYBR? Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)试剂盒购自大连TaKaRa公司，柱式全血RNAout试剂盒、柱式动物RNAout试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天泽基因，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克公司。

　　1.2　实验动物和样品处理

　　6个月的健康普通鸡，购自江苏大学农贸市场。采集鸡的新鲜血液，加入抗凝剂EDTA,4 ℃保存。随后迅速采集鸡的食道、心脏、肝脏、肌胃、腺胃、脾脏、嗉囊、十二指肠、肾脏、外表皮、肌肉、肺、卵巢、直肠、盲肠、空回肠，共16种组织。用4 ℃预冷的PBS清洗后，放入含有组织储存液的EP管，-80 ℃保存。

　　1.3　生物信息学分析及系统树构建

　　从NCBI的基因库数据库中下载人的IFITM3蛋白序列。以人的IFITM3序列为查询序列，利用Ensembl数据库的BlastP功能在线搜索鸡的基因组数据，寻找鸡的IFITM3同源序列。若预测得到的同源蛋白质不是全长序列，则通过电子克隆的方法获得其编码序列所在的最长contig片段，利用Genscan(http：∥genes.mit.edu/GENSCAN.html)在线预测编码序列所在的开放阅读框(ORF)，进而将其两端补全。

　　利用SMART(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)对鸡的IFITM3蛋白结构域进行在线预测;利用SOSUI(http：∥bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)在线预测蛋白质跨膜区及蛋白质亲疏水性区域的分布;利用Compute pI/Mw在线计算蛋白理论分子量和等电点(http：∥expasy.org/tools/pi_tool.html);利用CSS-Palm 2.0软件分析棕榈酰化位点。利用MEGA 4.0中的Clustal W程序进行多序列比较，利用MEGA 4.0计算蛋白序列间的进化距离(p-distance，即两条氨基酸序列比较时， 差异氨基酸个数占氨基酸序列总长的比例)。以MEGA 4.0[10]中的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发生树，采用默认参数，并通过自举检验(bootstrap test)重抽样1 000次估计系统树各分枝的自展值。

　　构建系统树所用的人和鼠IFITM蛋白序列如下：人IFITM1(Homo sapiens，NP_003632.3)、人IFITM2(H.sapiens，NP_006426.2)、人IFITM3(H. sapiens，NP_066362.2)、人IFITM5(H.sapiens，NP_001020466.1);鼠IFITM1(Mus musculus，NP_081096.2)、鼠IFITM2(M.musculus，NP_109619.1)、鼠IFITM3(M.musculus，NP_079654.1)、鼠IFITM5(M.musculus，NP_444318.1)。

　　1.4　荧光定量RT-PCR分析鸡的IFITM3组织分布

　　血液和组织总RNA的提取分别按照柱式全血RNAout试剂盒和柱式动物RNAout试剂盒的说明书进行操作。所得的RNA采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测。以总RNA为模板，Oligo(dT) 为引物，按逆转录说明书反转录合成cDNA第一链。以鸡的β-肌动蛋白为内参基因，采用荧光定量RT-PCR技术研究IFITM3基因在不同组织中的差异表达。荧光定量RT-PCR用到的引物，由上海Invitrogen 生物有限公司合成(表1)。PCR 反应体系，SYBR? Premix Ex Taq?(TaKaRa)(2×) 12.5 μl，模板cDNA 3 μl，上、下游引物各0.5 μl(10 μmol/L)，Rox 0.4 μl，加8.1 μl去离子水至总体积25 μl。每个样品重复3次，同时设置空白对照。扩增条件：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s， 共40个循环。反应结束后，取扩增产物5 μl,1%琼脂糖凝胶进行电泳。得到荧光定量的结果后，每个组织的 IFITM3 mRNA表达量与β-肌动蛋白表达量的比为各个组织的表达量。由于IFITM3在脾脏的表达量最低，我们以脾为标准(参照)获得了其他组织相对脾脏的IFITM3相对表达量。表1　荧光定量RT-PCR所用引物

　　2　结　果

　　2.1　同源性分析

　　在人的IFITM蛋白家族中，IFITM3的抗病毒活性最强。以人的IFITM3作为查询序列，使用Ensembl数据库的BlastP功能在线搜索鸡的基因组数据，得到3条与人IFITM3相似的序列(期望值<4.3e-18)，序列号分别为ENSGALP00000006733、ENSGALP00000006737和ENSGALP00000032064，且均位于鸡的5号染色体上。其中，ENSGALP00000006733(1620304-1621805 nt)和ENSGALP00000006737(1617064-1618551 nt)距离较近，仅相差1 700 bp左右，而ENSGALP00000032064(15244061-15249351 nt)与这两条序列均相距很远，超过1 360万bp。3条序列与人的IFITM3蛋白序列相似性分别为27.7%、33.8%和31.8%。

　　将鸡的IFITM蛋白与人、鼠的IFITM蛋白进行系统发生分析(图1)。结果显示，ENSGALP00000006737与人、鼠的IFITM1、2、3亲缘关系最近，自展值为62%; ENSGALP00000006733与人、鼠的IFITM5聚在一起，自展值达到99%。而ENSGALP00000032064 位于ENSGALP00000006737与IFITM5之间，独自形成分枝。重抽样1 000次计算的bootstrap值标注于节点上。阴影表示鸡的IFITM3在系统树中的位置图1　NJ法构建的IFITM系统发生树使用MEGA4.0计算鸡的IFITM与人的IFITM之间的进化距离(p-distance)(表2 )。结果表明，ENSGALP00000006737与人的IFITM3间的进化距离最小(0.615)，ENSGALP00000006733与人的IFITM5间的进化距离最小(0.419)，ENSGALP00000032064与人的IFITM2间的进化距离最小(0.687)。　表2　鸡的IFITM与人的IFITM之间的进化距离

　　2.2　鸡IFITM3的序列分析及结构预测

　　根据系统发生关系和进化距离，可以推断ENSGALP00000006737为鸡的IFITM3。该蛋白完整序列含有113个氨基酸，相对分子质量为12 600，预测的等电点pI 为9.02。

　　对鸡的IFITM3二级结构进行预测，发现其与人的IFITM3具有相似的结构域组成，即含有两个长度相似的跨膜区(表3)，且N端和C端均位于胞外(图2)。对鸡的IFITM3进行结构域预测，发现其与人的IFITM3含有相同的结构域，即CD225(PFAM登录号：PF04505)结构域。该结构域为干扰素诱导蛋白特有的结构域。虽然如此，人IFITM3的N端胞外区比鸡IFITM3的N端胞外区多25个氨基酸，而且含有更多的疏水性区域(图3)。图2　人和鸡IFITM3的跨膜结构与S-棕榈酰化位点　表3　人和鸡IFITM3的跨膜区域分析图3　人的IFITM3和鸡的IFITM3亲水性分布图

　　2.3　鸡IFITM3的表达分析

　　荧光定量RT-PCR对鸡的IFITM3mRNA组织分布分析结果显示，IFITM3在血液没有表达，在其余的16种组织中有表达(图5a)。在IFITM3表达的组织中，脾的表达量最低，十二指肠表达量最高，为脾的85.7倍，盲肠和空回肠次之。其他组织的表达量介于空回肠和脾之间(图5b)。　表4　人和鸡IFITM3中可能的S-棕榈酰化位点图4　鸡、人、鼠IFITM3的序列比较

　　另外，IFITM3在肝脏的表达水平相对较高，为脾脏的31.7倍。相对消化道各组织的表达量，它处于中间水平，但明显高于非消化道组织的表达水平。

　　1. 食道;2. 心脏;3. 肝脏;4. 肌胃;5. 腺胃;6. 脾脏;7. 嗉囊;8. 十二指肠;9. 肾脏;10. 外表皮;11. 肌肉;12. 肺;13. 卵巢;14. 直肠;15. 盲肠;16. 血液;17. 空回肠;M：DL 2000　图5　荧光定量RT-PCR分析鸡IFITM3的组织表达

　　3　讨　论

　　近年来，禽类的养殖规模不断扩大，集约化程度不断提高，使得禽流感的传染和感染更加容易。家禽感染高致病型禽流感后，其致病率和死亡率高达90%～100%。另外，一些禽流感病毒还可以实现跨种感染人类的能力[11-13]，尽管它们在人与人之间并没有表现出有效的传播能力[14]，但病毒的快速进化为其在人类中的传播提供了潜在的可能性[15]。最近的研究发现，IFITM蛋白能极大地抑制禽流感病毒(H5、H7)的复制，其中IFITM3的抑制效果最强，这个发现为防止禽流感的传播提供了新的策略。因此，研究鸡的IFITM3对防止禽流感的暴发和跨种传播有重要意义。

　　本文通过搜索鸡的基因组数据并通过同源性分析获得鸡的IFITM3。该蛋白全长113个氨基酸，比人的IFITM3短20个氨基酸，氨基酸一致性仅有33.8%，跨膜区及胞内区相对较为保守。虽然鸡的IFITM3与人的IFITM3序列相似性较低，但两者却含有相同的二级结构，且均含有CD225结构域，提示IFITM3的结构及保守区域或者位点对于其功能有着非常重要的作用。除此，鸡的IFITM3共有4个可能的S-棕榈酰化位点，分别为Cys45/49/53/89，其中Cys49较为保守，为鸡IFITM3与人、鼠IFITM3共有的S-棕榈酰化位点。S-棕榈酰化是一种可逆的脂质共价修饰作用，其对IFITM3的抗病毒活性起着决定性作用[16]。已有的研究表明，将人IFITM3的3个半胱氨酸位点全部突变，IFITM3将完全失去抗病毒功能[16]。因此对鸡的IFITM3的潜在S-棕榈酰化位点，尤其是Cys49的进一步研究，将有助于了解鸡的IFITM3抗病毒活性及其作用机制。除了S-棕榈酰化位点，IFITM3的N末端21个氨基酸对于其抗病毒活性大小也有一定的影响[17]。由于鸡的IFITM3与人的IFITM3 N末端差异较大，仅含有2个保守位点(Gln和Pro),1个半保守位点(Phe/Tyr)，所以对该区域及其保守位点进行深入研究，将有助于了解鸡的IFITM3与人的IFITM3是否存在抗病毒活性差异。

　　荧光定量检测结果显示，鸡的IFITM3主要在消化道组织和肝脏表达。组织表达特征与人的IFITM3组织表达特征相似[18]，提示鸡的IFITM3对调节胃肠道免疫和肝脏免疫有重要作用。IFITM3蛋白主要通过限制病毒的入侵，阻止病毒的早期复制[8,17]，从而在抗病毒免疫中起到重要的作用。禽流感病毒通过消化道和呼吸道途径感染禽类，在这些组织大量表达IFITM3，对防止禽类自身感染和防止禽流感的跨种传播有积极作用。在非消化道组织检测到的微量表达说明IFITM3可能还参与免疫细胞信号转导、细胞粘着等重要功能。

　　IFITM3蛋白除对流感病毒有抑制作用外，还对其他不同类型的病毒有免疫效果，例如登革热病毒(Dengue Virus)、西尼罗河病毒(West Nile Virus)等[8]。虽然因物种的不同，IFITM3在组织的表达情况略有差异，但在与免疫相关组织中有更高的表达[18-19]。另外，Brass等[8]还发现，IFITM3蛋白的缺失极大地降低了IFN-α和IFN-γ的抗病毒效果。因此，IFITM3基因可能对家禽的机体免疫有重要作用。

　　鸡的IFITM蛋白家族含有3个成员。系统发生树表明，IFITM5在各物种发生分歧之前就已经形成，并率先与IFITM其他成员发生分化，所以鸡的IFITM5与人、鼠的IFITM5紧密聚在一起。之后，各物种内部又独自发生IFITM基因重复，产生IFITM1、2、3。所以各物种IFITM1、2、3独自聚集成簇。由于IFITM1、2、3都具有不同程度的抗病毒能力，提示除了鸡的IFITM3可能具有抗病毒活性外，另一个与人的IFITM2进化距离较近的成员可能也具有抗病毒活性。

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