作者：路西林,薛会敏,赵朝贤,杨建峰　　作者单位：邯郸市第三医院检验科(路西林、薛会敏); 河北工程大学医学院生化教研室(赵朝贤); 邯郸市邯钢医院检验科(杨建峰)

　　【摘要】目的 探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法 以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果 在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%，而经PCR扩增阳性率为86.1%，PCR扩增准确性为72.2%，敏感性为100.0%，特异性为33.3%。结论 真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。

　　【关键词】 聚合酶链反应;角膜溃疡，真菌性;诊断

　　Applied polymerase chain reaction detecting fungal corneal ulcer LU Xilin,XUE Huimin,ZHAO Chaoxian,et al.Department of Clinical Laboratory,Handan Third Hospital,Handan 056001,China

　　【Abstract】 Objective To establish a method for rapid detection of clinical suspect fungal corneal ulcer by polymerase chain reaction(PCR).Methods A pair of oligonucleotide sequences,which was bases on the conserved region of 18srRNA shared by medically important conditioned fungal,was used as the general primers to amplify the DNAs from clinical suspect fungal corneal ulcer in a PCR assay,and the result was contrasted with culture.Results A 400bp specific DNA product was successfully amplified. The positive rate of fungi culture among 36 clinical specimens was 58.3%, while that of PCR amplification was 86.1%.In addition,the accuracy of PCR method in this study was 72.2%,the sensitivity was 100%,and the specialty was 33.3%.Conclusion PCR with the general primers is suitable for rapid detection of fungal corneal ulcer because of quickness and high positive rate.

　　【Key words】 Polymerase chain reaction;Corneal ulcer,fungal;Diagnosis

　　真菌性角膜溃疡是一种严重的真菌感染性角膜病，致盲率高，近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，真菌性角膜溃疡的发病率呈上升趋势[1，2]，在我国某些地区已上升为角膜感染的首位[3]。许多病例特别是不典型病例早期明确诊断较为困难,进而延误了治疗，造成角膜穿孔、眼球摘除，因此寻找快速、准确的实验室诊断方法对临床早期诊断具有重要意义。真菌培养方法鉴定真菌费时费力，远远不能满足临床诊断、治疗的需要。为此，我们采用一对源于医学条件致病性真菌18srRNA保守区的寡核苷酸序列为通用引物，以聚合酶链反应(PCR)技术对36例临床上拟诊为真菌感染病例的标本进行检测，并与培养方法进行对比，报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 选择2007年12月—2008年11月来我院就诊的被临床拟诊为真菌性角膜溃疡患者36例，男21例，女15例;年龄16～81岁，中位数42.5岁;病程4d～3个月;左眼20只，右眼16只。

　　1.2 培养方法 所有患者均经1%丁卡因眼角膜局部表面麻醉，在无菌操作下用刮铲刮取角膜溃疡边缘和/或溃疡底部的菌丝苔被2份，1份做培养，在无菌操作下接种于沙氏琼脂培养基斜面，置于25～28℃、湿度40%～50%的温箱中孵育培养7～10 d，有真菌生长者根据菌落特征、颜色以及乳酸酚棉蓝染色镜检菌丝、孢子特征进行菌属鉴定;另1份做PCR检测。

　　1.3 PCR方法

　　1.3.1 DNA的制备： 刮取的另一份病灶组织放入已加入500 μl PBS的1.5 ml离心管内, 然后加入100 U溶壁酶(lyticase),37℃温育1 h，6 000×g离心1 min，弃上清，然后按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒(由杭州博日科技有限公司提供)说明书操作，提取的DNA做PCR[4]。

　　1.3.2 PCR检测： 真菌通用引物采用A1(5'ATTCCTCGTTGAAGAGCA3')和A2(5'ACTCAACACGGGGAAACT3')(由上海生工生物工程公司合成)，PCR总体积为25 μl，其中2×Taq PCR master mix(由天艮生化科技有限公司提供)12.5 μl，真菌上、下游引物各1 μl，DNA模板6 μl，体积不足部分用无菌双蒸馏水补足。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸5 min。反应结束后，样品在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。紫外灯下观察，凝胶成像系统下照相记录结果，在整个实验过程中均设立阳性、阴性对照，并严格按照操作规程进行操作[5]。临床标本经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳在400 bp处出现DNA扩增带者为阳性。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　36例患者的临床标本经PCR扩增真菌阳性31例，阳性率为86.1%;真菌培养阳性率为58.3%(其中镰刀霉属13例、链格孢属3例、曲霉属2例、青霉属1例、无孢菌属1例、念珠菌属1例)，临床标本真菌培养与PCR真菌扩增阳性结果比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。以真菌培养为“金标准”，PCR扩增准确性72.2%，敏感性100.0%，特异性33.3%表1 真菌培养与PCR扩增结果比较 注：与真菌培养比较，*χ2=8.1000，P<0.05

　　3 讨 论

　　真菌性角膜溃疡是角膜病中致盲性眼病之一，目前实验室诊断方法：角膜刮片直接镜检阳性率低，培养法虽是“金标准”，但耗时长[6]，PCR技术可体外大量扩增已知序列的DNA片段，使得极微量的DNA可在紫外线下被直接观察到，具有操作简单，敏感性高和准确性可靠等优点，因此近年来真菌性角膜溃疡的PCR检测越来越受到人们的重视。

　　我们利用真菌18srRNA高度保守区而设计通用引物A1(5'ATTCCTCGTTGAAGAGCA3')和A2(5'ACTCAACACGGGGAAACT3')对多种菌种进行PCR扩增实验，结果该引物对真菌组标本均能扩增，但不能扩增出其他菌种，证明此真菌通用引物具有高度特异性;对临床上拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测，并与培养方法对比，PCR检测结果31例阳性，扩增阳性率为86.1%，而真菌培养21例阳性，阳性率为58.3%，PCR扩增与真菌培养方法比较，差异有统计学意义(P<0.05)，PCR扩增阳性率明显高于培养法，说明PCR方法具有很高的检出率。以真菌培养为标准，PCR敏感性100.0%，显示PCR扩增具有高度敏感性。真菌培养的10例阴性中，有5例患者已有过不正规抗真菌药物治疗，考虑可能抑制了真菌生长，导致真菌培养均为阴性;另5例培养阴性的患者，考虑不易生长的真菌在临床常用普通真菌培养基上很难观察到，而利用PCR方法可以鉴定这些少见致病真菌[7]，同时特异性降低，只有33.3%，我们考虑采集标本时存在污染，应加强实验前质量控制。在检测时间上，真菌培养可以鉴别菌种，进行药敏实验，为临床药物治疗提供依据，但是真菌培养耗时长，一般需要7～10 d才能确定是否为真菌感染，而PCR技术可直接对患者角膜溃疡标本提取DNA，PCR扩增，1 d即可出具检验报告，其显著优点是敏感、快速。

　　综上所述，本实验对临床上36份拟诊为真菌性角膜溃疡的标本进行检测，培养阳性的标本PCR检测也呈现阳性，从而确认PCR检测结果的正确性;PCR需要1 d，而真菌培养鉴定需要7～10 d，PCR所需时间明显少于真菌培养鉴定的时间，有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断;PCR扩增阳性率明显高于培养法;本实验采用真菌通用引物进行PCR，只能扩增出真菌，不能确定是某个菌属，采用PCR技术确定菌属将是我们下一步研究方向。因此，应用PCR方法检测临床拟诊为真菌角膜溃疡患者快速、灵敏、特异，对患者的早期诊断和及时治疗具有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 Cami J,Farre M.Drug addiction[J].N Engl J Med，2003,349(10):975985.

　　2 曾静,黄明汉,王冬梅.真菌性角膜溃疡45例临床分析[J].国际眼科杂志,2008,8(4):830831.

　　3 廖源.伊曲康唑配合氟康唑滴眼治疗真菌性角膜溃疡25例临床观察[J].疑难病杂志，2008，7(2)：107.

　　4 刘素玲，冉玉平，曾蔚，等.一种适合于PCR反应的酵母菌、无绿藻及丝状真菌DNA提取方法[J].中国真菌学杂志，2006，1(6)：340342.

　　5 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版，南京：东南大学出版社，2006：934938.

　　6 Liesegang TJ.Fungal keratitis//Kaufman HE,Barron BA,McDonald MB,eds.The Cornea[M].2nd eds.Boston:Butter worthheinemann,1998:219246.

　　7 Mancini N,Ossi CM,Perotti M,et al.Direct sequencing of Scedosporium apiosperm um DNA in the diagnosis of a case of keratitis[J].J Med Microbiol,2005,54(9):897900.