张海燕,王军　　作者单位：广东省河源市卫生学校中医教研组，广东河源 517300

　　【关键词】 皮肤色素沉着 模型 动物 综述文献

　　黑素增多性皮肤病又称皮肤色素沉着，临床常见的此类疾病包括黄褐斑、雀斑、老年斑等。其中尤以黄褐斑最为多见。由于此类皮肤病一般无任何不适症状而仅见色素沉着，既往不甚引起人们的关注。近年来，随着经济发展和生活水平的不断提高，人们越来越注重外表美、皮肤美，加以环境污染、人口老龄化以及全球气温的上升，更多的人皮肤色素形成失调。有文献报道指出，日本对627例成年妇女的一项调查，结果显示69.8%的日本妇女在面部或其它暴露部位患有色素增加性皮肤病[1]。现已成为美容皮肤科常见的疑难病症之一。因此，研制出高效安全的美白祛斑新制剂，已成为目前药学和化妆品领域所致力追求的一个目标。其中建立切实可行的实验模型是药效学得以进行的一个关键环节。关于黑素增多性皮肤病实验模型研究、国内外均有报道，但无公认的造模方法，现将近几年来的实验模型研究归纳、分析、总结如下，以期对今后的探索有所启迪。

　　1 雌激素全身攻击法

　　黄褐斑作为黑素增多性皮肤病，是临床最常见的一种疑难皮肤疾病，尽管其病因病机十分复杂，但普遍认为，内分泌失调、紫外线照射、遗传是其发病的主要因素。过伟峰等[2]根据黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关及目前通行的“雌激素和黄体酮增多进而刺激黑素细胞而致色素沉着”的发病学假说，用黄体酮攻击雌性小鼠，使其内分泌紊乱来复制黄褐斑动物实验模型。并以肝、皮肤组织中酪氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量变化及皮肤黑素细胞增长情况考察造模是否成功的指标。其实验结果显示，以2倍(低剂量组)、8倍(高剂量组)于人临床等效量的黄体酮攻击雌性小鼠1个月，黄体酮高剂量组的皮肤、肝酪氨酸酶含量明显高于正常及低剂量组(P<0.01)，从而证实该小鼠模型符合黄褐斑发病的生化学改变特征。病理学检测可见模型组黑素细胞明显增多，成簇分布于毛囊基底细胞团中，呈强阳性反应(P<0.01)。正常组小鼠鼠抗人单克隆抗体HMB45标记皮肤仅在毛囊、皮脂腺基底细胞中见少量黑素细胞。病理图像学多参数定量分析结果显示，模型组皮肤黑色素着色面积、深度明显大于正常组(P<0.05)。这从病理学角度进一步证实，用本方法制作的小鼠黄褐斑动物模型是成功的。

　　2 紫外线照射法

　　2.1 紫外线照射法的在体模型研究

　　根据紫外线照射是黑素增多性皮肤病的主要加重和致病因素之一，Imokawa等[3]应用紫外线照射对黑素增多性皮肤病动物模型做了较为详细的研究。Imokawa选用棕黄色豚鼠，分别采用中波紫外线(UVB)、光化学疗法(PUVA)2种方法致黑素形成。在UVB连续3日照射后，可见明显的黑色沉着，1周后色素沉着达到最大量。病理切片显示：未经UVB照射的豚鼠表皮黑素含量为200～400/mm2;经UVB照射后豚鼠表皮黑素分布呈树枝状，含量达到800～1 000/mm2; PUVA采用长波紫外线(UVA)照射，同时向豚鼠腹腔注射8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)，连续照射1周后也可产生较为明显的色素沉着。并运用UVB造模观察了酪氨酸酶抑制剂对黑素细胞数和含量影响，证实了采用紫外线照射用于黑素增多性皮肤病动物模型研究的可行性。潘扬等[4]参考相关文献，对黑素增多性皮肤病之一的黄褐斑病因进行分析，日光照射是发生黄褐斑的重要因素。过度日光照射后黄褐斑几乎均加重。长期UVB照射可使黑素细胞增殖。根据这一假说进行了UVB照射复制黄褐斑动物实验模型研究。用UVB照射雌性白色豚鼠1个月，并以豚鼠皮肤黑素细胞病理形态学及皮肤和肝脏组织酪氨酸、SOD、MDA含量变化作为考察指标，进一步证实紫外线照射复制该模型的科学性。张萍等[5]运用紫外线照射正常人皮肤进行了人体色素斑试验模型的在体研究。采用日光模拟器人工光源，以连续紫外线(波段290～400 nm)照射健康受试者上臂内侧皮肤。观察不同照射剂量及照射后不同测量时间局部皮肤黑素测量值的变化。结果：紫外线照射后1周，各剂量组黑素测量值(L值)均达到高峰，而红斑测量值(a值)在紫外线照射1周时达到高峰后呈持续递减趋势(P<0.05)。结论：2.0 最小红斑量(MED)照射剂量是紫外线在正常皮肤诱导色素斑的最佳剂量，照射后1～4周是观察色素变化的最佳时机。为祛斑美白类产品的效果评价提供客观、稳定、可重复的实验方法。

　　2.2 紫外线照射法的离体模型研究

　　关于紫外线照射法的离体实验模型研究，方法比较成熟，国内外均有报道。多采用体外细胞培养技术，MTT法及NaOH法研究不同剂量紫外线照射对黑素细胞增殖和黑素含量的影响。Ramirer[6]观察了不同剂量紫外线(UV)对体外培养黑素细胞的影响。当照射剂量达200 mJ/cm2时，细胞树突数量增多，酪氨酸酶活性及细胞黑素总量均明显增加;但随照射剂量增大，细胞增殖呈下降趋势，直至停止。 项蕾红等[7]认为，UVA促黑素细胞增殖作用的照射主要在30 min以内，照射剂量在3.6 J/cm2以内。当照射剂量从3.6 J/cm2增加到21.6 J/cm2，促黑素细胞增殖率无明显增加。张琳西等[8]观察了UVB对体外培养的人黑素细胞的影响，UVB照射后黑素细胞明显增殖，黑素含量增加，认为UVB可使局部暴露皮肤色素沉着。周敏等[9]在研究黄芩甙对紫外线诱导的人正常黑素细胞黑素合成的抑制作用时，分别经隔日UVA或UVB照射，观察细胞增殖情况。其中，UVA使细胞增殖增快，但剂量较大时增殖减慢;UVB使细胞增殖减慢。但二者均可使细胞酪氨酸酶活性和黑素含量高于对照组。

　　2.3 微量定点注射法辅以紫外线照射

　　作为黑素增多性皮肤病之一的雀斑，其形成主要是由遗传和环境因素共同决定，其为常染色体显性遗传。日光曝晒或紫外线的过多照射可促发本病并使其加剧。丁克祥等[10]据此以及雀斑的外形采用微量定点注射法将黑斑形成液注入幼年猪皮下不同深度，辅用紫外线照射以形成类似雀斑和色斑的实验动物模型。具体实验方法为：采用特制黑斑定位板固定在动物已备皮处，消毒后，将已配制好的黑斑形成液充分混匀后依次进行皮下注射。以后每日1次用黑斑形成液轻轻点擦外部相应处，并每日用紫外线灯照射;对照组用0.9%氯化钠注射液代替黑斑形成液。连续60日后，取猪背部的对照皮肤和黑斑形成处皮肤进行切片、染色，并用光镜和电镜进行观察。结果：受试动物皮下形成肉眼可见的类似雀斑形状和大小的黑斑斑点。通过皮肤组织切片染色并用光镜和透射电镜观察，黑斑形成处黑素细胞产生的黑素颗粒比与正常对照组明显增多(P<0.05)。虽然动物模型的黑斑与人体雀斑病因学和发生机制不完全相同，出现的条件和影响因素也有很大差异，但动物模型所形成的黑斑与雀斑在外部形状、大小以及内部组织学结构及色素改变都比较相似。因此，作者认为此动物造模方法可以作为雀斑的实验模型。小 结 综上所述，目前黑素增多性皮肤病的实验模型主要有雌激素全身攻击法、紫外线照射法及微量定点注射辅以紫外线照射等几种方法。其中，雌激素全身攻击小鼠，使其内分泌紊乱及国内外的紫外线照射法与黄褐斑的发病原因相似。但也应注意到动物模型本身并不完善，只是单一的从病因的1个方面反映了疾病的表现，尚不能完全理解黑素增多性皮肤病发病的复杂因素，且动物的病因学与人的相似性仍存在不确定性，基础实验与临床应用还有差距。针对紫外线照射法，要对建立模型的各项指标如照射剂量、观察时间及测量指标等进行优化比较，进一步完善实验模型;人类雀斑的形成主要由显性遗传诱发色素代谢紊乱所致，并受内分泌、药物、季节、日光、心理等多种因素影响，而微量定点注射辅以紫外线照射形成的动物黑斑则完全依赖黑斑形成液和紫外光等外源性因素诱导产生，且动物所处的实验环境已基本不受雀斑形成因素的影响;离体的黑素细胞培养法又与在体黑素细胞有一定的差异。故黑素增多性皮肤病的实验模型仍需要不断摸索经验，完善实验条件，进一步建立完美的实验模型。

　　【参考文献】

　　[1]Lijima M.Nisin resistance in listeria monocytogenes ATCC700320 is a complex phenotype[J]. J Appl Cosmetol, 1998,16(3):119-124.

　　[2]过伟峰,徐立,项晓人,等.建立小鼠黄褐斑实验动物模型的初步研究[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(2):49-51.

　　[3]Imokawa G, Kawai M, Mishima Y,et al.Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB, PUVA, and allergic contact dermatitis using a brownish guinea pig model[J].Arch Dermatol Res,1986,278(5):352-362.

　　[4]潘扬,曹亮, 刘世聪,等.建立黄褐斑实验动物模型的初步研究[J].成都中医药大学学报,2003,26(4):27-29.

　　[5]张萍,刘玮,信许亚,等. 人工紫外线诱导正常皮肤色素斑的初步研究[J].临床皮肤科杂志,2006,35(4):211-213.

　　[6]Ramirez-Bosca A, Bernd A, Werner R,et al. Effect of the dose of ultraviolet radiation on the pigment formation by human melanocytes in vitro[J]. Arch Dermatol Res,1992,284(6):358-362.

　　[7]项蕾红,郑志忠,祝绿川,等.长波紫外线照射对培养的正常人黑素细胞增殖及黑素合成的影响[J]. 中华皮肤科杂志,1999,32(6):391-392.

　　[8]张琳西,王臻,郭树忠,等. 中波紫外线对体外培养的人黑色素细胞的影响[J].中国美容医学,2001,10(3):180-182.

　　[9]周敏,李利,周光平. 黄芩甙对紫外线诱导人正常黑素细胞黑素合成的抑制作用研究[J].临床皮肤科杂志,2002,31(10):613-614.

　　[10]丁克祥,陈华东,赵莉,等.实验动物黑斑模型的建立及其研究[J].中国美容医学,2000,9(1):6-7.