王博,吕毅,张晓刚,李晖,仵正,潘承恩　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安

　　【摘要】 目的 探讨脾切除联用环孢素对协调性异种移植心脏存活时间的影响及其机制。方法 建立协调性异种心脏移植模型。分别采用不同时间脾切除联用环孢素，观察异种移植物的生存时间。用CH50法检测各组动物血清中总补体活性。应用流式细胞技术检测动物血清中异种反应性抗体IgG、IgM的滴度变化。移植物标本HE染色观察病理学改变。免疫组化染色观察各实验组不同时间移植物组织中IgG、IgM抗体的沉积。结果 脾切除联用环孢素能够显著延长移植物的生存时间(P<0.05)，降低受者体内异种反应性抗体的滴度。结论 脾切除联用环孢素可以减少移植术后早期受者体内异种反应性抗体的产生，延长异种移植物的生存时间。

　　【关键词】 异种移植;环孢素;心脏移植

　　同种异体器官移植成为终末期肾脏、心脏、肝脏等疾病的常规治疗手段，已经为越来越多的患者所接受。但是，人类供体器官缺乏一直困扰着器官移植的发展。用合适的动物作为器官供体，可能成为解决器官缺乏的有效手段之一。自20世纪60年代起，人们用非人类器官进行异种移植的尝试以来，已经进行了肾、心、肝脏等器官异种移植。但是，异种移植的免疫排斥反应较同种移植更为强烈。协调性异种移植(concordant xenotransplantation)中，移植物虽不发生超急性排斥反应，但是在移植术后3-4d内将会发生急性血管排斥反应(acute vascular rejection, AVR)。近年来研究发现，诱生型异种反应性抗体(elicited xenotractive antibody, EXA)在AVR中起到重要作用。EXA结合于移植物血管内皮细胞上，激活补体、活化血管内皮细胞，产生一系列黏附分子和前炎症细胞因子，最终导致移植物被排斥[1]。因此，通过调节移植术后早期EXA的产生可能延缓或减轻排斥反应的发生。本试验中，我们将通过不同时间脾切除联用环孢素对受者进行干预，观察异种移植物在受者体内的存活情况，初步探讨异种反应性抗体在异种排斥反应中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组

　　供体为健康成年金黄地鼠70只，80-100g，雌雄不拘。受体SD大鼠70只，180-200g，均购自西安交通大学医学院实验动物中心。采用“双套入”法建立金黄地鼠对SD大鼠协调性异种心脏移植模型。将实验动物随机分为6组：对照组(n=10)，不予任何治疗措施;环孢素组(n=10)，移植当日起每日腹腔注射环孢素10mg/kg;脾切除组(n=10)，移植心脏复跳后即予以脾切除;D0脾切除+CsA组(n=15)，移植心脏复跳后即予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg;D1脾切除+CsA组(n=15)，移植术后1d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg;D3脾切除+CsA组(n=10)，移植术后3d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg。

　　1.2 术后处理与观察

　　每组随机选取5例实验动物观察移植心脏存活时间。移植心脏复跳至停跳的时间为异种移植物存活时间[2]。移植心脏存活时间大于30d认为长期存活。移植物在3d内停跳，视为手术失败。

　　1.3 血清标本与组织标本的采集

　　分别于移植术后1、2、3、7、14、30d剖杀动物取血清、移植心脏标本，将血清标本保存在-20℃低温冰箱中，以备检测血清中补体活性和异种反应性抗体IgG、IgM的滴度。取供体心脏组织进行HE染色的组织病理学检测。

　　1.4 CH50实验检测各实验组血清补体溶血活性

　　配制2%(体积分数)绵羊红细胞悬液。各实验组血清、正常大鼠血清(对照)稀释20倍。用生理盐水将溶血素稀释为2u/mL。在各管中分别加入试剂和反应物，放入37℃水浴箱中温浴30min。选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上，540nm波长条件下，测量读取吸光度A值。每毫升血清总补体活性(单位)=1/血清用量×稀释倍数。

　　1.5 异种反应性抗体IgG、IgM的测定

　　应用流式细胞技术测定对照组、D1脾切除+CsA组、D3脾切除+CsA组大鼠血清中异种反应性IgG、IgM抗体[3]。采用CellQuest软件分析系统进行数据处理。实验动物血清中所含异种反应性IgG、IgM抗体相对滴度应用下列公式表示：异种反应性IgG、IgM抗体相对滴度=各实验组血清平均荧光强度/正常大鼠血清平均荧光强度。

　　1.6 免疫组化染色检测各实验组移植物组织中异种反应性抗体IgM、IgG的沉积

　　石蜡切片脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温下孵育20min。微波抗原修复，10%(体积分数)山羊血清封闭。滴加一抗，抗体稀释度为1∶50，置冰箱4℃过夜。加聚合物增强剂50-100μL，在37℃反应20min后，每张切片滴加DAB显色液。移植物组织中IgG、IgM沉积时阳性表达的判定：移植物血管内皮细胞表面和组织中可见棕黄色颗粒样物质沉积。

　　1.7 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，SPSS10.0软件包进行数据分析，P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 移植心脏存活时间

　　脾切除组、D0脾切除+CsA组、D1脾切除+CsA组、D3脾切除+CsA组移植物存活时间明显较对照组延长。环孢素组移植物生存时间与对照组无显著性差异。各实验组移植心脏存活时间见表1。表1 不同组异种移植物的存活时间(略)

　　2.2 移植物的病理学改变

　　对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组移植心脏发生排斥反应时，光镜下可见广泛血管内血栓形成伴心肌组织间大量的出血。心肌组织中大量的单个核细胞、淋巴细胞浸润(图 1A)。D0脾切除+CsA组、D1脾切除+CsA组移植术后第14天时，心脏组织中可见炎细胞浸润，无明显出血、血栓形成。移植术后第30天时，可见少量微血栓形成，未见明显组织出血，组织间有少量单个核细胞和淋巴细胞浸润(图 1B)。

　　2.3 各组不同时间CH50值的变化

　　正常SD大鼠血清总补体活性为(86.6±11.5)u/mL(正常参考值范围为50-100u/mL)。本实验中，对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组受体体内总补体活性在术后明显下降，提示受者体内大量补体活化。D0脾切除+CsA组和D1脾切除+CsA组受体血清CH50值在移植术后处于正常范围内。

　　2.4 异种反应性抗体IgG、IgM在移植心脏组织中的沉积

　　对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组，移植心脏发生排斥反应时，组织中可见大量IgG、IgM沉积于血管内皮细胞表面(图1C-D)。D0脾切除+CsA组和D1脾切除+CsA组长期存活(生存时间大于30d)的移植心脏血管内皮细胞表面可见异种反应性抗体的沉积(图1E-F)。

　　2.5 各实验组动物体内抗异种反应性抗体的变化 对照组、D1脾切除+CsA组、D3脾切除+CsA组大鼠血清中异种反应性IgM、IgG抗体的变化(图2-4)。

　　3 讨 论

　　在协调性异种移植时，异种抗原刺激受者免疫系统可以产生较高水平的诱生型异种反应性抗体(elicited xenotractive antibody, EXA)[47]，抗体结合于异种移植物血管内皮细胞表面，激活补体、活化内皮细胞[8]，继而导致排斥反应的发生。排斥反应的发生与EXA IgM、EXA IgG关系密切[9]。EXA IgG的产生是T细胞依赖性的。这类抗体的产生可以被环孢素等T细胞免疫抑制剂所抑制。EXA IgM的产生是T细胞非依赖性的，其产生不受环孢素等T细胞免疫抑制剂的影响。异种移植中，脾脏是产生T细胞非依赖性抗体和B淋巴细胞介导的体液免疫反应的重要器官[10]。脾脏的超微结构有利于抗原识别和抗原特异性效应细胞的产生[11]。有研究表明，产生异种抗体的B淋巴细胞主要存在于大鼠脾脏内[1214]。因此，我们推测可以通过脾切除来抑制受者体内异种反应性抗体的产生，从而延缓异种移植的急性血管排斥反应的发生。本试验中，我们通过不同时间脾切除联用环孢素，观察移植物在受者体内的生存时间。环孢素组移植物生存时间与对照组间无显著性差异，提示EXA IgM在急性血管排斥反应中起到重要作用。脾切除组移植物生存时间较对照组延长2-3d，但不能使异种移植物长期存活。证实协调性异种移植时，EXA IgG也参与了急性血管排斥反应。手术当天和术后第1天脾切除联用环孢素后，异种移植物能够在受者体内长期存活。CH50实验显示对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组受者体内的总补体活性逐渐升高，直至发生排斥反应。然而，D0脾切除+CsA组和D1脾切除+CsA组受者体内总补体活性始终处于正常范围内。通过检测受者体内异种反应性抗体滴度后发现：尽管D1脾切除+CsA组实验动物体内存在一定量的异种反应性抗体，但其一直处于低水平。这与移植术后早期脾切除联用环孢素有关。其可能原因是：低水平的异种反应性抗体不足以激活补体。随着移植时间的延长，受者体内的异种反应性抗体虽然有升高趋势，但移植物仍然没有被排斥。这可能与移植物本身发生的一系列改变有密切关系，即低浓度的抗体对内皮细胞的持续性刺激导致内皮细胞对损伤的敏感性下降[1516]。D3脾切除+CsA组由于在移植术后第3天进行脾切除，不能在早期抑制EXA IgM的产生。因此，移植物不能长期存活。综上所述，通过抑制移植术后早期受者体内异种反应性抗体的产生使其处于较低水平，可以显著延长异种移植物的生存时间，有利于减少排斥反应的发生。

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