涂国华,姜旭淦,李礼,吴亮　　作者单位：江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏 镇江

　　【摘要】目的：建立高效液相色谱(HPLC)测定糖化血红蛋白(GHb)方法，并对其进行评价。方法：以Bio-Rex 70阳离子交换树脂为填料，在HPLC仪上采用梯度洗脱分离测定GHb，对其分析性能进行评价。对50例健康人和50例糖尿病患者标本中糖化血红蛋白A1c(HbA1c)的含量进行测定。结果： Hb、HbA0和HbA1c的吸收光谱一致，吸收峰均为415 nm。该法能使HbA1c与HbA1(a+b)、HbA0清楚分离，HbA1c峰面积或峰高与标本中HbA1c含量成正比。对临床标本测定的变异系数为0.54%～1.15%;平均回收率为97.7%，质控品的实测值在标示值范围内;在0～15.8%范围内线性良好;未见脂血、黄疸对测定的干扰;标本稳定性与保存条件和标本特性有关。健康人和糖尿病患者HbA1c检测结果分别为3.3%～6.1%和6.8%～14.4%。结论： Bio-Rex 70-HPLC法测定糖化血红蛋白具有精密度好、准确度高、线性范围宽等优点，可用于GHb或HbA1c常规方法的评价和临床标本的分析。

　　【关键词】 糖化血红蛋白;高效液相色谱;离子交换树脂

　　[Abstract]　Objective： To establish and evaluate a high pressure liquid chromatography(HPLC) method for determing glycosylated hemoglobin(GHb). Methods： Taking the Bio-Rex 70 cation exchange resin as filler， GHb was separated and determined with HPLC analyzer by gradient elution. The analysis performances were evaluated. Meanwhile， the HbA1c contents of 50 healthy and 50 diabetic patients samples were determined. Results： The absorption spectrums of Hb， HbA0 and HbA1c were consistent， the absorption peaks were 415 nm. Using the HPLC method HbA1c could be clearly separated from HbA1(a+b) and HbA0 and HbA1c peak area or peak height was proportional to the HbA1c content in samples. The CV of clinical specimen determination was 0.54%～1.15%. The average recovery was 97.7%. The actual measured values of the controls were in range of the marked values. The linearity was good in the range of 0～15.8%. The interference of lipidemia and jaundice on the determination had not be observed. The specimen stability was concerned with storage conditions and specimen characteristics. HbA1c results of the healthy persons and diabetes patients were 3.3%～6.1% and 6.8%～14.4% respectively. Conclusion： Bio-Rex 70-HPLC method has advantages of good precision， high accuracy and wide linear range. It can be used for evaluating clinical GHb or HbA1c conventional methods and analyzing clinical specimens.

　　[Key words]　glycosylated hemoglobin; high pressure liquid chromatography; ion exchange resin

　　糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)是血液中红细胞内血红蛋白(hemoglobin，Hb)与碳水化合物通过非酶促作用形成的化合物。HbA与糖结合部分为HbA1，未结合糖部分为HbA0。根据所结合的碳水化合物不同，GHb分为HbA1a1、HbA1a2、HbA1b、HbA1c[1]，其中HbA1c约占HbA1的80%，是Hb的一条或两条β链氨基末端与葡萄糖羰基形成的稳定加成化合物[2]。HbA1c的含量与血糖浓度呈明显正相关，能直接反应血糖升高患者近期血糖控制情况，已经成为糖尿病血糖控制的金标准[3]。

　　目前，临床上GHb和HbA1c定量检测方法很多，按原理可分为三大类：①以糖基化与非糖基化组分电荷差异为基础的方法，如阳离子交换层析、电泳、等电聚焦等;②以结构特征差异为基础的方法，如亲和层析、免疫法;③依据化学反应性不同而设计的方法，如酶法、比色法[4]。由于各种方法的原理和分析性能不同，对GHb参考值的确定和测定结果的溯源可比性带来了挑战，给临床糖尿病的治疗以及监测带来困难。近年来国际相关组织一直致力于GHb测定的标准化和结果可比性，国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)、糖尿病控制与并发症试验(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT) 和美国糖化血红蛋白标准化计划(National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP)都推荐以不同介质的HPLC方法为GHb检测的参考方法[5]。本文以Bio-Rex 70离子交换树脂为固定相，优化实验条件，建立了GHb的HPLC检测方法，并在临床标本的应用中取得满意结果，为临床GHb常规方法的评价和校准品、质控品的赋值打下基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　仪　器

　　HPLC仪为Waters公司生产，检测器为Waters 2487，双泵为515 pump;紫外可见分光光度计为日本岛津UV-2550;高速离心机为eppendorf-5417R。

　　1.2　主要试剂与材料

　　Bio-Rex 70离子交换树脂(200～400目，Na+型)、糖化血红蛋白校准品(批号AA91200/AA91201)和质控品(批号33731/33732)购自Bio-Rad 公司。另一套糖化血红蛋白校准品(批号1209081)和质控品(批号1208071)购自四川迈克生物科技有限公司。氰化高铁血红蛋白(HiCN)比色法试剂购自上海荣盛生物药业有限公司。

　　1.3　临床标本采集

　　按照糖尿病的诊断标准[3]，于2010年5月至7月在镇江市第一人民医院收集糖尿病患者血液标本50份和经体检各项指标正常的健康人血液标本50份。所有标本采用EDTA-K2抗凝，2～8 ℃保存，2 d内测定。

　　1.4　溶血液的制备

　　按IFCC参考方法中制备要求进行[6]。主要步骤如下：抗凝全血室温1 000×g离心10 min去血浆，压积红细胞加入约5倍体积生理盐水洗涤2次，再加入约5倍体积生理盐水于37 ℃孵育4 h,1 000×g离心10 min去上清，压积红细胞加4倍体积的20 mmol/L EDTA-Na2(pH7.0)，剧烈振荡5 min后离心(3 000×g,5 min,4 ℃)，吸取上层血红蛋白液测定。

　　1.5　HPLC法分离GHb实验条件的建立

　　1.5.1　测定用试剂

　　A液：40 mmol/L PBS(pH 6.6);B液：300 mmol/L NaCl(pH 6.4，20 mmol/L PBS配制)。用0.45 μm滤膜超滤，加盖保存备用。

　　1.5.2　Bio-Rex 70树脂的活化与装柱

　　树脂活化过程参照文献[7]，活化后树脂采用A液保存。委托江苏汉邦科技公司装HPLC柱(6 mm×200 mm)。

　　1.5.3　梯度分析条件设置

　　新HPLC柱在检测标本前，使用A液平衡1 h，流速1 ml/min。测定梯度：0～8 min为100% A;8～18 min为70% A+30% B;18～35 min为100% B。检测时温度22～25 ℃。

　　1.5.4　检测波长的确定

　　制备的溶血液经适当稀释和根据HPLC分析图谱收集的HbA1c、HbA0峰值洗脱液经适当浓缩后在岛津UV-2550紫外可见分光光度计上进行光谱扫描，扫描波长范围为200～800 nm。

　　1.6　HPLC法检测GHb的方法学评价

　　1.6.1　精密度

　　选择临床高值、低值标本分别重复测定10次，计算变异百分率(CV%)。

　　1.6.2　准确度

　　通过回收试验和测定质控品的结果来评价。

　　1.6.2.1　回收实验

　　取迈克公司高值校准品(15.8%)适量，用少量生理盐水溶解，用HiCN比色法测定新鲜标本溶血液和校准品的血红蛋白浓度，并调整到50 g/L。制备基础样本和分析样本1、分析样本2。①基础样本：新鲜标本溶血液0.45 ml+0.05 ml生理盐水;②分析样本1：新鲜标本溶血液0.45 ml+0.02 ml校准品+0.03 ml生理盐水;③分析样本2：新鲜标本溶血液0.45 ml+0.05 ml校准品。每个样本重复测定3次，记录测定结果并计算回收率。

　　1.6.2.2　质控品的测定

　　已建立的方法用伯乐校准品校准后，测定质控品，重复测定3次，计算平均值，观察实测值与标示值之间的差异。

　　1.6.3　线性范围

　　取迈克公司提供的低值校准品(5.1%)和高值校准品(15.8%)，用20 mmol/L EDTA-Na2溶解后，以HiCN法测定Hb浓度，并调整使浓度相等，低值和高值分别按3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3比例混合，配制成5.1%,7.8%,10.5%,13.1%，15.8%共5个系列浓度。观察实测值与理论计算值差异。

　　1.6.4　干扰物质的影响

　　取临床高胆红素(300 μmol/L)和高三酰甘油(10.8 mmol/L)的抗凝全血标本，离心分离得血浆。将分离的血浆与GHb正常和高值标本的压积红细胞混合后，再按上述标本处理方法制备溶血液进行GHb检测，观察胆红素和三酰甘油处理前后的差异。

　　1.6.5　标本稳定性

　　抗凝全血4 ℃储存1周内每天测定1次。溶血液分装储存于-20 ℃和-70 ℃，于1周、1个月、3个月和6个月时检测。

　　1.6.6　临床标本的检测

　　糖尿病患者血液标本50份和健康人血液标本50份，按照上述方法制备溶血液进行测定。

　　2　结　果

　　2.1　Hb、HbA0和HbA1c的吸收光谱

　　红细胞溶血液经适当稀释后，在可见紫外分光光度计上于200～800 nm波长范围进行光谱扫描;将溶血液经HPLC仪分离，分别收集HbA1c峰和HbA0峰洗脱液，再行扫描，结果见图1。图1　Hb、HbA0和HbA1c的吸收光谱由图1可见，Hb、HbA0和HbA1c的吸收光谱一致，吸收峰均为415 nm，故选择415 nm监测HPLC法分析GHb洗脱过程。

　　2.2　HPLC法分离GHb效果观察

　　采用本法能将HbA1c与HbA1(a+b)、HbA0清楚分离，见图2，峰1为HbA1(a+b)，峰2为HbA1c，峰3为HbA0。HbA1(a+b)、HbA1c和HbA0峰值保留时间分别在2～3 min、13～14 min和24～26 min，HbA1c峰面积或峰高与标本中HbA1c含量成正比。图2　HPLC分离临床标本GHb

　　2.3　HPLC法测定GHb的方法学评价

　　2.3.1　精密度

　　临床标本1测定10次，测得HbA1c平均值为10.47%，CV为1.15%。临床标本2测定10次，测得HbA1c平均值为6.87%，CV为0.54%。

　　2.3.2　准确度

　　回收实验测得分析样本1、分析样本2的回收率分别为96.5%和98.9%，平均回收率为97.7%。用Bio-Rad公司校准品(标定值为5.3%和10.6%)对仪器调校后，对质控品进行测定。 Bio-Rad公司质控品标示范围为3.6%～4.8%和6.9%～9.3%，实测值分别为4.0%和7.8%;迈克公司质控品标示范围为3.7%～5.7%和8.7%～11.7%，实测值分别为4.5%和10.1%。

　　2.3.3　干扰

　　在标本溶血液制备中，经离心去血浆和洗涤红细胞等步骤，未观察到脂血、黄疸对GHb测定的干扰。

　　2.3.4　标本稳定性

　　抗凝全血标本4 ℃一周内结果无差异。溶血液-20 ℃存放可稳定7 d;-70 ℃存放在6个月内未见变化。

　　2.3.5　线性范围

　　图3为本法测定HbA1c系列浓度的实测值与理论计算值之间的关系，可见线性范围较宽，在0～15.8%范围内线性良好。图3　HPLC法检测HbA1c的线性范围

　　2.4　临床标本的检测结果

　　健康人血液标本50例， HbA1c检测结果为3.3%～6.1%。糖尿病患者50例，HbA1c检测结果为6.8%～14.4%。

　　3　讨　论

　　目前，临床常用的糖化血红蛋白检测方法有离子交换层析法、亲和层析法和免疫比浊法，各种方法均有其优缺点。①离子交换树脂HPLC法测定HbA1c具有准确、重复性好、自动化操作较简单等优点，但环境温度、缓冲液的离子强度和pH对测定结果影响很大，只有在22～25 ℃层析结果稳定、准确[8]。②亲和层析法用盐酸洗涤层析柱使其再生，可重复使用[9]，具有操作简单、对温度不敏感、不受异常Hb影响等优点[2]，但二元醇结构与硼酸的结合并非完全特异[8]，镁离子可促进二元醇结合到硼酸基团[10]，胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)超过20%会影响亲和层析[11]。同时应注意亲和层析测定的是总糖化血红蛋白[12]，不能测定糖化血红蛋白的亚组分。③免疫学方法有胶乳凝集免疫比浊法、胶乳凝集抑制法、酶联免疫吸附法和免疫比浊法等，免疫比浊法可直接用自动生化分析对样品进行快速测定，但胆红素等有干扰。

　　Bio-Rex 70阳离子交换树脂是将弱羧酸功能基团连接到丙烯酸上的非球形微粒，使用不同离子强度和pH值的磷酸盐缓冲液来洗脱可以分离GHb及其组分，为DCCT和NGSP参考方法所采用[5]，国内曾有用于手工测定GHb的报道。由于Bio-Rex 70阳离子交换树脂应用普遍且容易获得，分离GHb及其组分效果较好，故为本研究所采用。结果表明采用本法能将HbA1c与HbA1(a+b)、HbA0清楚分离，并且HbA1c峰面积或峰高与标本中HbA1c含量成正比。

　　在优化实验条件的基础上，本文对建立的测定GHb的HPLC法进行了系统评价。结果显示本法精密度好，CV 0.54%～1.15%;准确度高，平均回收率为97.7%，质控品的实测值与标示值相符;线性范围宽，在0～15.8%范围内线性良好;溶血液制备中经离心去血浆和洗涤红细胞等步骤，可避免脂血、黄疸对GHb测定的干扰。通过对临床标本的检测，进一步说明了本法测定结果的可靠性和实际应用价值，健康人HbA1c检测结果为3.3%～6.1%;糖尿病患者HbA1c含量增加，检测结果为6.8%～14.4%，与DCCT报道的结果一致[5]。

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