黄加秀△,洪丽萍,石晶萍　　作者单位：江苏泰州，扬子江药业集团有限公司

　　【摘要】 目的 建立甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液无菌检查法。方法 采用薄膜过滤法，以枯草芽孢杆菌为预实验敏感菌株，以不同的冲洗量及是否添加中和剂为验证方法，探索此药物的无菌检查法。结果 本品在该实验条件下可有效去除抑菌成分，6种代表菌均能够正常生长[1]。结论 采用薄膜过滤法，用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗500ml，最后在每管培养基中加入5mol/L的MgCl2溶液4ml(最终浓度为0.2mol/L)可有效去除甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液中的抑菌成分。使检验结果准确可靠。

　　【关键词】 甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液;无菌检查法;方法学验证; 喹诺酮类抗生素

　　【Abstract】 Objective To establish a method for slerility test of Pazufloxacin Mesilate and Sodium Chloride Injection.Methods Membrane filtration method, with Bacillus subtilis as the pre-test sensitive strains, different flush volume and whether add the neutralizer were used to verify the sterility test method of this drug.Results The bacteriostatic ingredients can be effectively removed in this experimental conditions, six representativestrains grow normally. Conclusion The membrane filtration method, with pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone buffer wash 500ml, finally add 5mol/L of MgCl2 solution 4ml (final concentration 0.2mol/L) in each tube, can effective eliminate the antibacterial activity of this drug, so the test results are accurate and reliable.

　　【Key words】 Pazufloxacin Mesilate and Sodium Chloride Injection; Slerility test; Testing and verifying of the method; Quinolone antibiotics

　　甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液为第三代喹诺酮类抗生素，作用机理为DNA拓扑异构酶抑制剂，使细菌的DNA无法形成超螺旋结构，导致细菌细胞无法分裂和增殖而死亡，体内抗菌活性研究表明，本品对金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药株、肺炎链球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌黏质沙雷氏菌和绿脓杆菌有较强抗菌活性。《中国药典》2010年版规定，在建立一种药品无菌检查的方法时，应对方法进行验证以保证方法的可靠性，通过对甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液进行代表菌株的验证，证明所用的方法能够有效地去除其抑菌活性，适合该药品的无菌检查[2]。

　　1 材料与仪器

　　1.1 供试品

　　甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液(规格：100ml:0.3g，批号：10121412，扬子江药业集团有限公司)。

　　1.2 试验用菌种(第四代)

　　金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]，均来自中国菌种保藏中心。

　　1.3 稀释液、缓冲液和中和剂

　　0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、吐温80、5mol/L的MgCl2溶液。

　　1.4 培养基

　　营养琼脂培养基(批号：101110)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：100908)、硫乙醇酸盐流体培养基(批号：100910)、改良马丁培养基(批号：101103)、改良马丁琼脂培养基(批号：091225)、营养肉汤培养基(批号：101124)，均由北京三药科技开发有限公司提供。

　　1.5 仪器与材料

　　ZH-2型旋涡混合仪(上海沪西医疗仪器厂);HTY-601-型智能集菌仪(杭州高得泰林180转/min);KSF一次性全封闭集菌器(杭州高得泰林，批号：20110114);LRH-250型恒温培养箱(上海索普仪器有限公司)。

　　2 方法与结果

　　2.1 菌液制备

　　分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃~35℃培养18~24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23℃~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升小于100CFU的菌悬液; 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7 d，使大量孢子产生，加入3~5 ml 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液(管口带有薄的无菌棉花过滤菌丝)至灭菌试管内，用含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将菌液稀释至每毫升小于100 CFU的菌悬液，备用[3]。

　　2.2 菌落计数

　　每种菌液制备两个平皿，取其平均值。分别吸取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌1ml至平皿内，加约45℃营养琼脂培养基15ml，混匀，于30℃~35℃培养3天;吸取黑曲霉、白色念珠菌各1ml，加约45℃玫瑰红钠琼脂培养基15ml，混匀，于23℃~28℃培养5天;取生孢梭菌1ml至含100ml硫乙醇酸盐流体培养基的集菌器中,于30℃~35℃培养3天,分别点计菌落数。

　　2.3 方法研究

　　2.3.1 预实验

　　选择枯草芽孢杆菌为预实验组的敏感菌株。组一：安装好集菌培养器，先用每250ml含2ml吐温80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml润湿滤膜，以发挥滤膜的最大过滤效率。然后将30瓶样品分别抽入培养器的3支滤筒内，过滤。每张滤膜过滤量为10瓶。每只培养器用每250ml含2ml吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别冲洗500ml、700ml、900ml、100ml/次，边冲洗边振摇。冲洗结束后每管培养器中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基和1ml小于100CFU的枯草芽孢杆菌菌悬液。于30℃~35℃培养3~5d。组二：安装好集菌培养器，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml润湿滤膜，以发挥滤膜的最大过滤效率。然后将30瓶样品分别抽入培养器的3支滤筒内，过滤。每张滤膜过滤量为10瓶。每只培养器用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别冲洗500ml、700ml、900ml、100ml/次，边冲洗边振摇。冲洗结束后每管培养器中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基和1ml小于100 CFU的枯草芽孢杆菌菌悬液及5mol/L的MgCl2溶液4ml(终浓度为0.2mol/L)[4]。于30℃~35℃培养3~5d。试验结果见表1。　　表1 预实验结果

　　2.3.2 验证试验

　　(1)试验组：取集菌器6管，先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，过滤样品，每张膜10瓶，然后再用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml冲洗，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入1ml试验菌，冲洗结束后加入100ml培养基和5mol/L的MgCl2溶液4ml(终浓度为0.2mol/L)[4]。细菌采用硫乙醇酸盐流体培养基，真菌采用改良马丁培养基。(2)中和剂对照组：方法同试验组，不加样品。(3)阳性对照组：取集菌器6管，分别加入1ml试验菌和100ml培养基。细菌采用硫乙醇酸盐流体培养基，真菌采用改良马丁培养基。(4)阴性对照组：方法同试验组，不加样品和菌液。硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基各一管。结果见表2。表2 验证试验结果

　　2.3.3 样品的无菌检查

　　取样品30瓶，照上述薄膜过滤法同法操作，每张滤膜过滤的样品量为10瓶，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml冲洗，100ml/次，冲洗结束后，其中两管泵入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，一管泵入改良马丁培养基，再分别加入5mol/L的MgCl2溶液4ml。最后向一支硫乙醇酸盐流体培养基管中加入小于100 CFU的金黄色葡萄球菌作为阳性对照。3支管分别在相应温度下(细菌30℃~35℃，真菌23℃~28℃)培养14d，逐日观察，供试品管均澄清，阳性管生长良好，判供试品符合规定。

　　3 讨论

　　甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液为第三代喹诺酮类抗生素，具有很强的抑菌性，单纯通过一般性的冲洗或薄膜过滤等方法，不能抑制其抑菌活性，无法满足无菌检测的要求，故需通过建立新的验证试验以消除其抑菌活性，既要保证所有阳性对照菌正常生长，还能够准确地检测样品的染菌情况。试验结果表明：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗500ml，并加入4ml 5mol/L的MgCl2溶液，即可有效地消除其抑菌活性，6个代表性的菌株均生长良好，故可用作甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液的无菌检查法。MgCl2有很高的溶解度，且一般不影响微生物的生长，故添加高浓度的MgCl2溶液可以作为其他喹诺酮类抗生素的无菌性验证及检测提供参考!

　　【参考文献】

　　1 费嘉,杨峰,贾阳,等.复方利多卡因注射液无菌检查法验证.医药导报,2010，29(6):798-799.

　　2 国家药典委员会.中华人民共和国药典.二部.北京:化学工业出版社,2010:附录103-107.

　　3 朱梅红,吉同琴,刘留成,等.注射用兰索拉唑无菌检查方法学研究.西北药学杂志,2008,23(6):381-383.

　　4 裴小龙,黎隽,杨晓莉,等.盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查法Mg2+加入方法验证 .西北药学杂志,2010,25(6):446-447.