董以泉,金立方,辛铭,金东辉　　作者单位：武警吉林省总队医院，吉林 长春

　　【关键词】 一氧化氮 出血性休克 一氧化氮合酶

　　一氧化氮(NO)是一种自由基，由一氧化氮合酶(NOS)从左旋精氨酸胍合成。一氧化氮合酶(NOS)目前确定有三种同功酶(NOS1、NOS2、NOS3)。NO自由基在出血性休克时可以大量产生，并且在出血性休克中起着极其重要的作用。本文就近年来NO在出血性休克中的作用机制进行综述。

　　1 NOS 在出血性休克中的作用

　　1.1 NOS NOS是NO生物合成的限速酶，是含血红素的蛋白酶，有大量的辅助因子，包括四氢生物喋吟(BH4)、黄素单核苷酸(FMN)、还原型辅酶 II (NADPH)和钙调蛋白(CaM)等。目前已确定NOS的3种同工酶是根据NOS存在细胞类型不同进行分类的，分为诱导生成型(iNOS)、内皮细胞型NOS(endothelial cNOS，ecNOS or eNOS )、神经原型NOS (neurognic cNOS，ncNOS or nNOS) 3种，依照国际命名法，分别称为NOS1、NOS2、NOS3。根据NOS活性的基本调控条件可分恒定地表达的组成型或原生型(cNOS)和必须经过诱导才能表达地诱导型或诱生型(iNOS)两种。

　　1.2 NOS和NO NOS三种同功酶含有大量的辅基：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、四氢生物蝶呤、一个血红素复合体和铁原卟啉Ⅸ。最近，锌被认为是NOS另一个辅基。NOS分两个步骤合成NO,并且iNOS 生成NO是在适当底物存在下以严格方式进行的〔1，2〕：首先合成NG脱氧左旋精氨酸，第二步是这种中间产物三电子氧化过程。所有NOS同功酶都依赖于NADPH和CaM。NO生成与氧分子整合进入分子体内有关，NO是脂溶性小分子，可弥散到临近细胞，自由进入胞质，在胞质中通过结合在血红素铁离子上并将铁离子移出卟啉环平面而激活可溶性鸟苷酸环化酶。NO(局部高浓度)细胞毒作用有：抑制关键性有丝分裂Fes酶、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、辅酶Q氧化还原酶、琥珀酸氧化还原酶和抑制顺乌头酸酶〔3〕。NO还可抑制细胞色素P450酶〔4〕，调节基因转录和翻译;同时在内皮细胞中还可激活cfos〔5〕，而在神经原中它可使cfos启动子有关的基因表达的钙发挥作用〔5〕。细胞间钙浓度下降与血管和非血管平滑肌的舒张、血小板黏附和聚集的抑制、中性粒细胞化学趋化的抑制和中枢和周围神经系统信号传递有关〔3，6〕。cGMP的增加可通过增加钙的吸出将钙收集入细胞内，从而降低细胞外钙的浓度。目前已知NO也有非cGMP依赖性的作用，NO激活的其他非cGMP依赖性酶，如环加氧酶，这种作用与NO和环加氧酶活化点上铁血红素中心相互作用有关〔7〕。

　　1.3 NOS在出血性休克中的作用 出血性休克时可伴随NO过度生成,应用电子旋转超声技术发现，在出血性休克早期就有NO的过度生成〔8〕，这种作用又通过来自体内具有收缩能力的主动脉环和iNOS活性的增高的测量进一步被证实。此外,iNOSmRNA功能增强在出血性休克的小鼠的巨噬细胞中得到证实〔9〕，在休克抑制期中(血管失代偿期)iNOS可在不同组织中被诱导。NOS抑制剂在出血性休克中的作用包括：可以使心输出量增加，改善肾血流和肾小球滤过率，防止肠道损害及器官损伤和增加存活率。最近的研究表明，选择性iNOS抑制剂氨基胍(一种低效力但对iNOS高度选择性的抑制剂)在鼠出血性休克模型中可改善存活率。巯基乙基胍(MEG)是另一种新的iNOS抑制剂，在抑制过氧化亚硝酸盐诱导氧化方面有独特的重要的药理学的作用，研究表明，MEG在出血性休克鼠模型中于复苏前给药具有明显的保护作用〔10〕。MEG在出血性休克中可明显降低亚硝酸盐/硝酸盐量，提示它作为iNOS的抑制剂是有效的。近年来研究表明，MEG在出血性休克复苏期间能明显改善血压降低和心输出量，肺动脉压和血管阻力以及耗氧量也随着MEG治疗而增加，而且MEG可明显提高存活率。NOS抑制剂可减少大部分器官的血流,内皮细胞源性NO对循环血细胞黏附和活化有调节作用，如NO可抑制血小板的黏附和激活以及中性粒细胞的黏附，抑制内皮细胞源性NO生成可诱发微血管损伤，这种作用对出血性休克的病理生理非常重要。出血性休克对基础NO合成的抑制非常敏感，这因为出血性休克内皮源性NO生成的“基线”损害和内皮依赖性松弛减低。在体外，缺氧可上调iNOS的现象与在出血性休克中iNOS的表达有相同之处，iNOS的诱导机制包括再转录和新蛋白的生物合成，其表达可在转录水平和mRNA稳定性两个方面上调节〔4〕。iNOS的诱导可被许多因子抑制，包括糖皮质激素、凝血酶、巨噬细胞去活化因子、TNFβ、血小板源生长因子、IL4、IL8、IL10和IL13，诱导iNOS免疫刺激因子，也可诱导GTP环化水解酶，它可产生BH4，这样可给iNOS提供辅助因子。iNOS的诱导与精氨琥珀酸合成酶的诱导有联系，精氨琥珀酸合成酶的诱导通过启动从左旋胍氨酸到左旋精氨酸再循环来给iNOS提供细胞内源的底物。

　　1.4 NOS在出血性休克炎症反应瀑布过程中的作用 出血性休克时可触发以细胞因子产生增加，白细胞黏附分子表达以及中性粒细胞渗入组织为特点的炎症瀑布式过程，中性粒细胞在出血性休克复苏中被认为是组织损伤的重要效应器。为确定出血性休克中诱生的NO是否在复苏中参与炎症反应信号传递进行的基础实验表明，iNOS基因缺失小鼠中肝和肺脏的转录因子核因子kB(NFкB)明显降低，随着复苏4～6 h IL6和GCSF的mRNA水平也降低。IL6和GCSF都可激活转录因子和转录子3激活因子(STAT3)的信号传递，STAT3的激活也因iNOS活性缺乏而下降。随着转录因子激活的减少和细胞因子表达的下降出现中性粒细胞渗入肺明显减少和肺、肝损伤的明显减轻〔11〕，提示在出血性休克中NO执行关键的信号传递功能。然而，NO介导的信号传递一个特殊方面就是与氧化还原应激有关，在抗氧化能力下降状态下，NO或反应产物过氧化亚硝酸盐能激活细胞外氧化还原敏感的信号传递旁路。最近的研究证实，NO能激活p21(ras)引起NFкB的活化，提示在出血性休克中氧化还原信号传递存在一个潜在机制〔12〕。iNOS生成的NO(或过氧化亚硝酸盐)作为炎症反应的增强剂也被实验所证实〔13〕，在过敏性脑脊髓炎的病程中抑制iNOS可抑制TNF的产生，在关节炎病程中抑制iNOS便可抑制IL1、胶原酶和基质溶素的产生，在利什曼原虫病的鼠模型中抑制iNOS可抑制INFγ的产生。

　　2 过氧化亚硝酸盐在出血性休克中的作用

　　过氧化亚硝酸盐通常被认为是细胞毒分子，在低浓度时有完整的抗氧化系统介导生理效应。在基础生理条件下有少量的过氧化亚硝酸盐产生，大部分细胞在低水平NO中由于内源性抗氧化系统足以中和这种低剂量的过氧化亚硝酸盐的产生，因此也就没有细胞毒作用的生成。低浓度的过氧化亚硝酸盐可抑制中性粒细胞黏附，在这种情况下，过氧化亚硝酸盐可形成NO，并与葡萄糖、硫基等形成加合物，这加合物又能做为NO供体激活鸟苷酰基环化酶。目前，过氧化亚硝酸盐的生理作用知道非常少。过氧化亚硝酸盐在出血性休克和其他病理生理状态下的实际作用从实验中证明有一定困难，但理论上支持当NO和超氧化物同时产生时也产生过氧化亚硝酸盐，超氧化物与NO反应只是竞争超氧化物与超氧化物歧化酶。虽然化学方面支持过氧化亚硝酸盐的产生说法，但它在病理生理状态下的存在或产生报道甚少。在体外，过氧化亚硝酸盐可迅速氧化荧光探针哈马灵123使之变成罗丹明123，过氧化亚硝酸盐的增加可作为血浆哈马灵123氧化成罗丹明123的反应增加的证据〔14〕。使用这种检测方法在出血性休克中，在过氧化亚硝酸盐依赖的哈马灵123转化成罗丹明过程中，被标记的NOS抑制剂被检测并得到证实〔14〕。

　　3 过氧化亚硝酸盐检测剂与清除剂

　　硝基酪氨酸形成和其免疫染色的检测以前被认为是检测过氧化亚硝酸盐“足迹”的相对特异的方法〔15〕。但近些年证据表明，一定有其他反应诱导酪氨酸硝基化，如亚硝酸盐与次氯酸盐反应，髓过氧化物酶与过氧化氢反应也能导致硝基酪氨酸的形成。这种反应的生理或病理生理变化有待进一步澄清。最近观点认为，将增加的硝基酪氨酸染色应作为硝基化的增加的指标，而不应作为过氧化亚硝酸盐特异标识。硝基酪氨酸的形成最近在出血性休克大鼠的主动脉得以证实，这种染色在用iNOS抑制剂和过氧化硝酸盐清除剂(MEG)治疗的动物上呈阴性。

　　4 在出血性休克中过氧化亚硝酸盐的作用机制

　　4.1 过氧化亚硝酸盐与蛋白(酶)的作用 实验研究表明，超氧化物和NO比例决定着过氧化亚硝酸盐的反应，过多的NO可减少由过氧化亚硝酸盐向NO的转化。过氧化亚硝酸盐的氧化反应由具有羟自由基生物活性的中介体所介导，它本质上不是羟自由基，而是过氧化亚硝酸盐或它的活性异构体。体外实验证明，过氧化亚硝酸盐是高反应性的，它可诱导巯基和硫醚的氧化以及芳香化合物的硝化和羟化如酪氨酸、色氨酸和鸟氨酸。这些作用当在过氧化亚硝酸盐与细胞各种酶反应时能明显抑制这些酶的催化活性。研究显示，过氧化亚硝酸盐可抑制锰超氧化物歧化酶、酪氨酸羟化酶、膜钠钾ATP酶、膜钠通道的甘油醛3磷酸脱氢酶、线粒体和胞质的顺乌头酸酶和线粒体呼吸链中一些重要的酶以及NOS〔16〕。

　　4.2 过氧化亚硝酸盐与核酸的关系 除了它与蛋白质反应外，另一重要的反应是它与核酸的关系，两种主要的反应是DNA的基础修饰和DNA单链裂解。氧自由基清除剂、NOS抑制剂和过氧化亚硝酸盐清除剂在出血性休克中的保护作用是与预防过氧化亚硝酸盐触发的细胞毒作用有关。然而，许多机制如脂质过氧化、蛋白质修饰、线粒体抑制仍有待进一步研究。除了直接细胞毒作用外，现推测过氧化亚硝酸盐诱导细胞损伤还有间接的路径，不论细胞内或细胞外所产生的过氧化亚硝酸盐已被证明能够触发DNA单链裂解和激活核酶多聚二磷酸腺苷(ADPribose)合成酶(PARS)〔17〕。当PARS被激活后，它可催化NAD(辅酶I)裂解成ADP核糖和尼克酰胺。PARS以共价键形式将ADPribose结合到不同的核蛋白上(如组蛋白和PARS本身)，激活的PARS能迅速清除NAD，减低糖酵解电子传送和ATP合成的速率，导致细胞功能障碍和细胞死亡。药理学上已证明，对PARS活性的抑制可防治内源或外源产生的过氧化亚硝酸盐反应对细胞的损害〔16〕。另一方面，过氧化亚硝酸盐(低水平，长时间存在)也能经凋亡旁路导致细胞死亡。然而，PARS对后面过程不起作用，因为对PARS的抑制不能防止过氧化亚硝酸盐诱发的凋亡。近些年来实验的研究显示，在重度失血性休克的模型中应用PARS抑制剂5碘基6氨基1，2苯丙芘治疗的大鼠，在生存率上有明显的改善;延长存活时间50%(从30 min到70 min)，而且治疗组的动物可维持较高的平均动脉压〔17〕。

　　4.3 凋亡机制 过氧化亚硝酸盐介导细胞毒作用另一次要机制是激活凋亡前胱冬酶(Caspase3)瀑布效应。研究显示，在细胞暴露于过氧化亚硝酸盐时Caspase3被激活，Caspase3激活后可诱发细胞凋亡〔18〕。Caspases3的激活与受过氧化亚硝酸盐诱导的线粒体的细胞色素C的释放有关，Caspases3可导致凋亡DNA片段的形成，抑制Caspase3可抑制过氧化亚硝酸盐诱导的细胞凋亡。

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