作者：张秋实,李继俊,赵兴波　　作者单位：1.广州市妇婴医院妇产科; 2.山东省立医院妇产科

　　【摘要】目的 观察抗孕激素米非司酮对人子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响，并探讨其作用机制。方法 体外培养子宫内膜癌HHUA细胞株，不同浓度米非司酮处理细胞24～96h，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察米非司酮对HHUA细胞增殖活性的影响;免疫组化技术观察HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达的变化。结果 米非司酮以时间剂量依赖性方式，显著地抑制人子宫内膜癌HHUA细胞的体外增殖活性(P<0.05);当米非司酮浓度≥5μmol/L作用细胞24h后，子宫内膜癌HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达水平明显降低。结论 抗孕激素米非司酮以时间剂量依赖性方式显著抑制子宫内膜癌HHUA细胞的体外增殖活性，并与降调Ki67和cmyc基因表达密切相关。

　　【关键词】 米非司酮;子宫内膜癌;增殖活性;基因

　　近年有关抗雌激素三苯氧胺和抗孕激素米非司酮及其衍生物用于子宫内膜癌治疗的研究已见报道，但对于米非司酮治疗子宫内膜癌细胞作用的分子学基础研究相对较少，本研究拟通过观测抗孕激素米非司酮 (mifepristone)对人子宫内膜癌HHUA细胞体外抗增殖作用，在细胞分子生物学水平，从细胞增殖活性、基因表达方面探讨米非司酮抑制子宫内膜癌细胞体外增殖的作用机制，为临床上应用抗孕激素药物治疗子宫内膜癌提供实验依据。表1 不同浓度米非司酮处理HHUA细胞24～96h生长抑制率(以5μmol/L组为例)vs 0.1μmol/L组和1μmol/L组，*P<0.01;各组间两两比较，P<0.05

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人子宫内膜癌细胞系HHUA为高分化子宫内膜腺癌细胞，含有17β雌二醇受体和孕激素受体以及野生型p53、p21等基因，由山东大学荣凤年博士惠赠。

　　1.2 实验试剂与药物

　　米非司酮(RU486)纯品由北京第三制药厂提供。甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品。鼠抗人Ki67和cmyc单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，免疫组化染色试剂盒( HistostainPlus Kits)购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3 方法

　　人子宫内膜癌HHUA细胞在含有RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)的96孔培养板中37℃、饱和湿度、5%CO2、恒温培养24h，加入不同浓度米非司酮使其终浓度分别为0(对照)、0.1、1、5、10、50和100μmol/L。每孔中总体积为200μl，每种药物每种浓度设置5个复孔，继续培养24～96h后，每孔加入配制好的MTT(5mg/ml)20μl，培养箱内继续培养4h，酶标仪测定每孔的吸光度A值(波长分别为560nm和630nm)，计算细胞生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

　　在每孔底面铺有洁净小玻片的12孔培养板中用上述方法培养子宫内膜癌HHUA细胞24h，每孔换入含有米非司酮5μmol/L，10μmol/L的培养液，同时设立阴性对照孔，培养箱中继续培养24h，取出小玻片用纯丙酮固定20min，严格按免疫组化操作程序进行SABC法染色。

　　1.4 染色结果判断

　　参照AnsariLari等[1]的判断标准，按AB值法进行光镜分析表达强度。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据采用SAS 6.12软件进行方差分析及t检验。

　　2 结果

　　2.1 米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞生长的抑制作用

　　MTT法检测发现，在米非司酮≥5μmol/L时，HHUA细胞随药物作用时间的延长，生长抑制作用呈现增强趋势，差异有统计学意义(P<0.05);增高米非司酮浓度≥5μmol/L，细胞生长抑制率也随之上升，差异有统计学意义(P<0.05)。呈现出明显的时间浓度依赖关系。

　　2.2 米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达的作用

　　米非司酮5μmol/L作用HHUA细胞24小时后，免疫组化检测细胞Ki67和cmyc基因表达明显下调，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);增大米非司酮10μmol/L，未见到HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达下调出现增强的趋势，但与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05), 米非司酮作用子宫内膜癌HHUA细胞24小时Ki67、cmyc基因表达变化

　　3 讨论

　　3.1 米非司酮的抗肿瘤作用

　　米非司酮是法国Roussel Uclaf药厂于1981年研制成功，最初用于抗早孕和紧急避孕，近年来应用范围已扩大到治疗多种妇科疾病和抗肿瘤，目前米非司酮抗肿瘤研究已涉及到乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，脑膜瘤，神经胶质瘤及子宫肌瘤[2，3]。米非司酮属II型孕激素受体拮抗剂(Type II antiprogestins)，与孕激素受体结合后促进孕激素受体二聚化并与DNA结合，而发挥其作用。本研究揭示了II型抗孕激素米非司酮能显著抑制子宫内膜癌HHUA细胞体外增殖活性，这一研究结果与Li等[4]的研究报道相近，表明米非司酮具有抗子宫内膜癌增殖的潜能，这将为临床抗子宫内膜癌治疗提供了一条新途径，也为子宫内膜癌的内分泌治疗提供了可靠的实验依据。

　　3.2 抗孕激素米非司酮对细胞增殖基因Ki67、cmyc的作用

　　Ki67是一种增殖细胞相关核抗原，分子量为345KD和395KD，其抗体的表达范围覆盖除G0期以外的各增殖周期，Ki67的功能与有丝分裂密切相关[5]，在细胞增殖周期中是不可缺少的，Ki67在肿瘤组织中呈现高表达，并与肿瘤细胞增殖活性和肿瘤细胞倍增时间密切相关，因此，近年来在许多肿瘤研究中均将Ki67表达水平作为衡量肿瘤细胞增殖活性的指标。cmyc基因编码一种具有环螺旋亮氨酸链的蛋白质，蛋白质以二聚体的形式发挥转录因子的作用，激活转录作用[6]。cmyc基因在正常子宫内膜和异位子宫内膜均有表达，并在增生期的表达高于分泌期，在人类许多肿瘤中，cmyc基因蛋白基于癌基因的增幅(拷贝数增加)而呈现过度表达，从而刺激肿瘤细胞不断分裂、增殖甚至发生转移。研究表明，子宫内膜癌中存在有cmyc基因增幅(扩增)，并与癌细胞分化密切相关。在本研究中发现，米非司酮≥5μmol/L体外作用子宫内膜癌HHUA细胞24h，可使细胞Ki67的表达水平明显降低，导致HHUA细胞有丝分裂受阻，癌细胞增殖活性被降低。同样，米非司酮也使子宫内膜癌细胞cmyc表达水平明显降调，引起子宫内膜癌细胞cmyc蛋白的促转录作用减弱，使子宫内膜癌细胞的分裂、增殖受阻，肿瘤生长势头减缓。因此，调控癌细胞增殖基因的表达是米非司酮抗子宫内膜癌作用的分子学机制之一。

　　综上所述，抗孕激素米非司酮作为孕激素受体拮抗剂，通过降调HHUA细胞cmyc、Ki67的表达水平，抑制癌细胞分裂、增殖，并且其抑制作用具有时间剂量依赖性。本研究还发现，子宫内膜癌HHUA细胞cmyc和Ki67表达水平的降调与米非司酮剂量无正相关性，故推测子宫内膜癌细胞在高浓度(>5μmol/L)米非司酮作用下，可通过其他机制抑制癌细胞生长，如直接细胞毒作用以及抗糖皮质激素作用[7]。

　　【参考文献】

　　[1] AnsariLari MA,Staebler A,Zaino RJ,et al.Distinction of endocervical and endometrial adenocarcinomas: immunohistochemical p16 expression correlated with human papillomavirus (HPV) DNA detection[J].Am J Surg Pathol,2004,28(2):160167.

　　[2] Gaddy VT,Barrett JT,Delk JN,et al.Mifepristone induces growth arrest,caspase activation,and apoptosis of estrogen receptorexpressing,antiestrogenresistant breast cancer cells[J].Clin Cancer Res,2004,10 (15):52155225.

　　[3] Sridhar S,Ali AA,Liang Y,et al.Differential expression of members of the tumor necrosis factor alphavelated apoptosisinducing ligand pathway in prostate cancer cell[J].Cancer Res,2001,61(10): 71797183.

　　[4] Li A,Felix JC,Minoo P,et al.Effect of mifepristone on proliferation and apoptosis of Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells[J].Fertil Steril,2005,84(1):202211.

　　[5] Cao QJ,Einstein MH,Anderson PS,et al.Expression of COX2,Ki67,Cyclin D1,and P21 in Endometrial Endometrioid Carcinomas[J].Int J Gynecol Pathol,2002,21(2):147154.

　　[6] Iuengar RV,Pawlik CA,Krull EJ,et al.Use of a modified ornithine decarboxylase promoter to achieve efficient cmyc or Nmycregulated protein expression[J].Cancer Res,2001,61(7): 30453052.

　　[7] Dahmoun M,Backstrom T,Boman K,et al.Apoptosis,proliferation,and hormone receptors in endometrial carcinoma: Results depending on methods of analysis[J].Int J Oncol,2003,22 (1): 115122.