作者：仲崇俊,蒋庚西,陶国华,王永旺　　作者单位：南通大学第二附属医院，江苏 南通

　　【摘要】[目的] 探讨非小细胞肺癌患者外周血中肺表面活性蛋白D mRNA(SP-DmRNA)表达在围手术期的变化及其意义。[方法]应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测40例非小细胞肺癌(NSCLC)组织中SP-DmRNA的表达;分别在手术前、关胸时、术后1周检测40例肺癌患者外周血中SP-DmRNA的表达，并以15例肺良性病变患者和10名健康人作为对照。[结果] 40例NSCLC组织中SP-DmRNA阳性表达率为100%，手术前、关胸时和术后1周外周血SP-DmRNA表达阳性率分别为45.0%、52.5%和15.0%;15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无SP-DmRNA表达。[结论] SP-DmRNA是检测肺癌外周血微转移良好的分子标志物。

　　【关键词】 非小细胞肺癌　微转移　肺表面活性蛋白D　围手术期　外周血

　　Expression of Surfactant Protein D mRNA in Peripheral Blood of Non-small Cell Lung Cancer during Peri-operation Period and Its Clinical Significance

　　ZHONG Chong-jun, JIANG Geng-xi, TAO Guo-hua, et al.

　　(The 2nd Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, China)

　　肺癌细胞血行播散是肺癌转移、复发的主要方式之一。因未形成显性转移结节，且缺乏临床表现，常规检查方法如影像学、临床病理学方法等难以检测和发现。在肺癌微转移的研究中目前仍缺少公认的特异性分子标记物[1]。Ⅱ型肺泡上皮细胞被认为是肺癌的祖细胞，它能够合成分泌肺表面活性蛋白D(pulmonary surfactant protein D，SP-D)，而正常外周血单核细胞中不表达SP-DmRNA[2]。为此，我们选择SP-D作为分子标记物，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血，观察围手术期SP-DmRNA的表达变化，以探寻其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　40例NSCLC患者均来源于本院胸心外科，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移，其中，55岁及以上31例，55岁以下9例，男性30例，女性10例，腺癌22例，鳞癌18例。另外选择15例肺部良性疾病患者及10名健康人作为对照组。

　　1.2 方 法

　　试剂与引物设计：参照Genbank，采用Primer Premier5引物设计软件设计SP-D基因内外引物，SP-D-U:5′-AAAGTGTCGGGGAGAAGA，SP-D-D:5′-TCAGTCATGCTCAGGAAA，扩增产物长度178bp，内参引物为GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)以检测RNA的完整性，GAPDH-U:5′-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT，GAPDH-D:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，扩增产物长度306bp，由上海生工公司合成。

　　标本的收集与总RNA抽提：对所有肺癌患者于手术治疗前、手术结束关胸时和手术后1周抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol试剂一步法抽提总RNA，另对手术切除肿瘤于手术室内切取小块新鲜肿瘤组织液氮速冻保存，取约50mg~100mg行总RNA的抽提。

　　RNA鉴定：对所抽提的总RNA行紫外分光光度计定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。

　　cDNA第一链合成：取样品总RNA约2μg加入20μl反应体系中，按照试剂盒提供的条件进行逆转录。

　　巢式PCR扩增SP-DmRNA与GAPDH(内参)按照文献报道方法[2，3]，结合实验优化条件进行。具体为：SP-D PCR反应体系25μl，其中cDNA 2μl,10×PCR buffer 2.5μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.2μl，dNTPmix(2mM/L)2.5μl，MgCl2(20mM/L)1.5μl，SP-D上、下游引物(10pM/L)各1μl，加入适量的双蒸水，使总体积达25μl。反应条件:95°C预变性5min，95°C变性45s，48°C，45s，72°C，45s，共45个循环，在第15个循环末时加入GAPDH上、下游引物(10pM/L)各1μl，最后72°C延伸7min。

　　PCR产物分析：SP-D扩增产物5μl，加6×loading buffer 1μl混匀上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V恒压，30min，EB染色，在四星凝胶成像系统下拍照和分析。

　　1.3 统计学分析

　　使用STATA 7.0统计软件对资料进行分析，相关数据采用χ2检验和Fisher精确概率法进行处理。

　　2 结 果

　　2.1 总RNA鉴定

　　实验中抽提的总RNA OD260/OD280值在1.76~1.97之间，外周血抽提总RNA约50μg~100μg，1%琼脂糖电泳，EB染色可见28s、18s亮带。

　　2.2 肺癌患者和对照组SP-DmRNA的表达

　　SP-DmRNA在40例NSCLC组织中均为阳性，在15例肺部良性疾病患者(包括良性肿瘤、肺大泡、支气管扩张等)病变肺组织中表达均为阴性。

　　40例肺癌患者外周血中SP-DmRNA阳性21例，表达阳性率52.5%。15例良性肺疾病患者和10例健康对照者外周血中SP-DmRNA均阴性，SP-DmRNA在肺癌组与肺良性病变和正常人组中的表达差异具有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 外周血中SP-DmRNA表达与肺癌患者临床病理生理特征关系

　　40例肺癌患者中，55岁及以上31例，SP-DmRNA阳性18例，阳性表达率58.1%;55岁以下9例，SP-DmRNA阳性3例，阳性表达率33.3%，组间比较差异不具有统计学意义(P=0.27)。男性患者30例，SP-DmRNA阳性14例，阳性表达率46.7%;女性患者10例，SP-DmRNA阳性7例，阳性表达率70.0%，组间比较差异不具有统计学意义(P=0.28)。TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期患者28例，SP-DmRNA阳性11例，阳性表达率39.3%;Ⅲ期患者12例，SP-DmRNA阳性10例，阳性表达率83.3%，组间比较差异具有统计学意义(P=0.02)。肺癌不同病理分型中，腺癌22例，SP-DmRNA阳性16例，阳性表达率72.7%;鳞癌18例，SP-DmRNA阳性5例，阳性表达率27.8%，组间比较差异具有统计学意义(P=0.01)。低分化21例，SP-DmRNA阳性15例，阳性表达率71.4%;高分化19例，SP-DmRNA阳性6例，阳性表达率31.6%，组间比较差异具有统计学意义(P=0.03)。

　　2.4 关胸时和术后1周与术前外周血中SP-DmRNA表达比较

　　21例患者在治疗的不同时期中，出现外周血中SP-DmRNA表达阳性，其中术前阳性者18例，术中阳性者21例，术后1周阳性者15例。术中与术前的检出率差异不具有统计学意义(P>0.05)，术后1周与术前的检出率差异具有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　影响非小细胞肺癌(NSCLC)患者术后生存的主要因素之一是远处转移。即使是病理分期为Ⅰ期(T1N0M0)的非小细胞肺癌患者手术后仍有约30%的病人早期复发，且复发方式多为脑、骨、肺等血行性转移[4]，这预示着手术时切除范围以外的血液中已经有隐匿或微量癌转移细胞的存在。由于RNA对降解酶具有高度敏感性，外周血中并不含有RNA，血液中具有肿瘤特征性的mRNA只能存在于具有活性和完整形态的肿瘤细胞中。所以，检测到外周血中特异的mRNA存在就可以说明循环中微量癌转移细胞的存在[3]。RT-PCR技术的发展，使检测外周血中微量癌转移细胞成为可能。SP-D是一种在机体防御中起重要作用的钙结合凝集素，单体结构包括一个氨基末端、一个长的胶原片段、一个颈段和一个高度保守的球形碳水化合物功能区域[5]，在肺泡Ⅱ型细胞中呈现高表达[6]。动物实验表明[7]，患有肺癌鼠的外周血中SP-D表达增高，且增高水平与肿瘤大小呈正相关，认为SP-D可以用于观察治疗效果。Betz等[2]应用RT-PCR技术以SP-DmRNA作为转移标志物对肺癌患者淋巴结进行了检测，在106个正常淋巴细胞中检出1个癌细胞，而且在73.9%(17/23)的转移肺腺癌患者淋巴结中检出SP-DmRNA阳性，而8例对照全部阴性，也显示了其作为肺癌早期转移检测指标的价值。

　　本试验选择SP-D基因作为检测分子标志，用RT-PCR法检测了肺癌组织及外周血，表明SP-DmRNA作为检测肺癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感度和特异性。肺癌患者外周血微转移与患者年龄、性别无关，与肺癌TNM分期、组织学类型和癌细胞分化程度相关。手术切除原发肿瘤可能有利于降低肺癌的血行转移。

　　有3例患者术前外周血SP-DmRNA阴性，而术中外周血SP-DmRNA阳性，其在术后1周再转为阴性，关胸时与手术前比较，SP-DmRNA检测的阳性率差异不具有统计学意义(P>0.05)，其临床意义可能需要更大样本量才能确定，但此现象仍提示手术操作可能会促进肿瘤细胞进入外周血液，术中坚持无瘤操作原则是必要的。癌细胞进入血循环中的停留时间十分短暂，一般估计仅为数天，本组患者有6例在术后1周仍为阳性，病史回顾为Ⅲ期患者，推测在手术切除原发病灶后，癌细胞仍可能由远处转移病灶进入血液循环。

　　癌细胞进入血液和淋巴循环仅是肿瘤转移多阶段、多步骤中的一步。外周血中检测到癌细胞表明了癌细胞较强的转移潜能，预示着预后欠佳。

　　【参考文献】

　　[1] Osaki T, Oyama T, Gu CD, et al. Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage Ⅰ non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2002, 20(13):2930-2936.

　　[2] Betz C,Papadopoulos T, Buchwald J, et al. Surfactant protein gene expression in metastatic and micrometastatic pulmonary adenocarcinomas and other non-small-cell lung carcinomas:detection by reverse trarscriptase-polymerase chain reaction[J]. Cancer Res, 1995, 55(19):4283-4286.

　　[3] Von Knebel D,Lacroix J.Nucleic acid based techniques for the detection of rare cancer cells in clinical samples [J]. Cancer and Metastasis Rev, 1999, 18(1):43-46.

　　[4] Yasumoto K, Osaki T, Watanabe Y, et al. Prognostic value of cytokeratin-positive cells in the bone marrow and lymph nodes of patients with resected nonsmall cell lung cancer: a multicenter prospective study[J]. Ann Thorac Surg, 2003, 76(1):194-202.

　　[5] Crouch E,Wright JR.Surfactant proteins A and D and pulmonary host defense [J]. Annu Rev Physiol, 2001, 63: 521-554.

　　[6] Stahlman MT, Gray ME, Hull WM, et al. Immunolocalization of surfactant protein-D(SP-D) in human fetal, newborn, and adult tissues[J]. J Histochem Cytochem, 2002, 50(5): 651-660.

　　[7] Zhang F, Pao W, Umphress SM, et al. Serum levels of surfactant protein D are increased in mice with lung tumors [J]. Cancer Res, 2003, 63(18):5889-5894.