作者：赵鑫,李德春,张子祥,赵华,岑建农　　作者单位：江苏省苏州大学附属第一医院普外科;江苏省血液研究所

　　【关键词】 RNA干扰;Panc1;VEGF;PCR;ELISA

　　0引言

　　血管内皮细胞生长因子(VEGF)是体内一种内皮细胞特有的有丝分裂原，调控血管内皮细胞的增殖、迁移、水解基膜和血管构建，诱发血管期的启动[1，2] 。RNA干扰(RNAi)是一种重要的转录后基因沉默机制[3]。本实验拟构建以VEGF基因为靶向的RNA干扰质粒，沉默胰腺癌Panc1细胞株中VEGF基因的表达，为抑制胰腺癌血管生成提供基础。

　　1材料与方法

　　1.1主要材料siRNA真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP和阴性对照载体购自上海吉凯基因化学公司，abl、VEGF基因PCR引物及探针由上海生工公司合成;人VEGF ELISA试剂盒为美国R&D公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1pGCsiVEGF的构建与细胞转染参考siRNA的设计策略，从VEGF基因第三外显子上挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列(5'GGAGTACCCTGATGAGATC3′)，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，中间以9个脱氧核苷酸的Loop相连。取合成两条shRNA的模板单链，退火形成siRNA载体插入片断。取空质粒用BamHI和HindIII行双酶切，电泳，切胶，回收线性质粒，纯化。将上述片断接入线性化质粒，得到重组子命名为pGCsiVEGF。对其进行测序。脂质体法将pGCsiVEGF和阴性对照质粒转染Panc1细胞。转染后的细胞用含G418培养液筛选2周后挑取阳性单克隆继续培养4周，用流式细胞仪检测筛选后的GFP表达率。

　　1.2.2Real Time PCR和ELISA取转染阳性克隆细胞，提取细胞内总RNA，逆转录合成cDNA链。以看家基因abl的表达作为内参，abl和VEGF的引物及Taqman探针序列如下：Abl 引物：正义5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA  3′;反义5′ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG  3′; abl Taqman 探针：5′FAMAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATTAMARA  3′VEGF 引物：正义5′GGGCCTCCGAAACCATGAACTT 3′;反义5′CGCATCAGGGGCACACAG  3′; VEGF Taqman 探针：5′ FAMCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTAMARA  3′扩增条件：95℃ 5min，95℃ 20s，60℃ 1min，采集荧光信号，50个循环。对样本设复管检测，取平均值作为目的基因表达水平。abl、VEGF基因拷贝数按照江苏省血研所已建立的方法计算，以同一份样本VEGF基因拷贝数×102/abl基因拷贝数来计算VEGF基因表达水平，将未转染Panc1细胞(对照)设定为100%，计算出各组干扰效率。按照第219～280位碱基为插入片段序列，其中第225～271位碱基为siRNA目的片段序列图3流式细胞仪检测GFP表达率ELISA试剂盒操作说明，450nm可见光比色得吸光度(A)值，作为纵坐标，标准品浓度(pg/m1)为横坐标，绘制标准曲线，根据标本的A值得出上清液VEGF浓度。将未转染Panc1细胞(对照)设定为100%，计算出各组相对含量。

　　siRNA载体插入片断序列

　　重组质粒的测序鉴定

　　1.2.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件，两均数比较的t检验，以P<0.05为具有统计学差异。

　　2结果

　　2.1重组质粒测序表明目的片断已克隆入载体，表示质粒构建成功。截取部分测序结果。

　　2.2转染阳性克隆细胞GFP表达率G418筛选2周后挑取转染阳性单克隆细胞培养4周，Panc1/阴性对照载体和Panc1/重组子的GFP表达率分别为90.3%、94.7%。

　　2.3Real Time PCR和ELISA结果图4显示VEGF基因实时定量PCR检测标准曲线，不同实验间误差<5%。Real Time PCR和ELISA数据。

　　实时定量PCR检测各组的VEGF干扰效率及ELISA检测VEGF表达相对含量标本VEGF基因相对含量

　　注:★表示与Panc1组比较差异具有统计学意义,P<0.01;▲表示与Negative组比较差异具有统计学意义,P<0.01

　　VEGF基因实时定量PCR检测标准曲线

　　3讨论

　　肿瘤血管生成对实体瘤的生长起重要作用，血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管生成因子，通过促进血管内皮细胞的分裂和增殖、增加血管通透性，对肿瘤的发展、转移等发挥着重要作用。因此，有效地抑制VEGF的表达或降低其生物学活性是肿瘤抗血管生成治疗的关键。此前研究较多的有抗VEGF及VEGFR的单克隆抗体[5]，VEGF片段反义寡核苷酸技术[6]等。近年来兴起的RNA干扰技术，为肿瘤的治疗开辟了新的途径[7]。目前有化学合成法、体外转录法等多种合成siRNA的方法。这些体外得到siRNA后再导入细胞内的方法的主要缺点是：siRNA进入细胞前后容易被培养液或细胞内液中的RNA酶所降解。以质粒或病毒为载体介导的siRNA细胞内表达可以克服上述缺陷。Matsumoto等[8]学者将带有荧光标记的VEGF siRNA质粒表达系统注射鳞癌细胞NRS1的荷瘤小鼠，荧光显微镜观察发现十天后瘤周仍有荧光存在，而此时小片段的siRNA早已经消失了。本实验采用以质粒为载体构建重组体的方法，将siRNA对应的DNA双链序列连接入载体内，位于U6启动子后。U6启动子启动编码shRNA序列，它总是在一个固定距离的位置开始转录合成RNA，它的终止信号为TTTTT，转录产物在第二个T后切开，PolⅢ遇到终止信号时可准确终止转录。U6启动子对于小于400bp的序列可有效稳定转录，因此是我们的50～80bp RNA茎环的理想启动子[9]。这样重组体就能在细胞内表达特异的shRNA分子,并被Dicer酶加工后形成siRNA分子。意大利学者Niola等[10]将以质粒为载体的VEGF siRNA直接注射荷瘤的SCID小鼠，可以明显抑制肿瘤血管的生成。他们又将含有VEGF siRNA和鼠源性IL4序列的逆转录病毒载体瘤内注射SCID小鼠的皮下移植瘤，肿瘤血管和肿瘤本身生长都受到明显抑制。本实验成功构建了VEGF基因靶向RNAi真核表达载体，并能有效抑制胰腺癌Panc1细胞VEGF的表达，为进一步研究胰腺癌血管生成抑制奠定了基础。近来，Mulkeen等[11]发现结肠癌RKO细胞表达VEGF受体，在体外实验中将VEGF siRNA转染该细胞后，VEGF的表达下降了95%，同时结肠癌细胞本身的增殖也下降了67%，这就提示恶性肿瘤存在VEGF的自分泌环，本实验通过RNA干扰技术抑制VEGF的表达也为胰腺癌的基因治疗提供了新的思路。

　　【参考文献】

　　[1]Kamat BR, Brown LF, Manseau EJ, et al. Expression of vascular permeability factor vascular endothelial growth factor by human granulose and the calutein cells[J]. Am J Pathol, 1995,146(1):157165.

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　　[7]Fraser A.RNA interference：human genes hit the big screen[J].Nature，2004，428(6981)：375378.

　　[8]Matsumoto G， Kushibiki T， Kinoshita Y,et al. Cationized gelatin delivery of a plasmid DNA expressing small interference RNA for VEGF inhibits murine squamous cell carcinoma [J]. Cancer Sci, 2006, 97(4): 313321.

　　[9]Miyagishi M, Taira K. U6 promoterdriven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells[J]. Nature Biotech, 2002, 20(5): 497500.

　　[10]Niola F, Evangelisti C, Campagnolo L, et al. A plasmidencoded VEGF siRNA reduces glioblastoma angiogenesis and its combination with interleukin4 blocks tumor growth in a xenograft mouse model [J]. Cancer Biol Ther, 2006, 5(2):174179.

　　[11]Mulkeen AL, Silva T, Yoo PS, et al. Short Interfering RNA Mediated Gene Silencing of Vascular Endothelial Growth Factor: Effects on Cellular Proliferation in Colon Cancer Cells [J]. Arch Surg，2006, 141(4)：367374.