作者：余秉东,胡建华,贾绍斌　　作者单位：.宁夏医科大学附属医院心内科，银川 750004; 2.湖北省郧西县医院麻醉科，郧西 442600

　　1【摘要】 目的 探讨GPⅠbαKozak -5T/C基因多态性与冠心病相关性。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析检测208例宁夏回族人群(冠心病组96例，对照组112例)Kozak -5T/C基因型及等位基因频率。结果 208例宁夏回族人群GPⅠbαKozak -5T/C基因CC、CT和TT三种基因型分布频率分别为8.6%、23.1%和68.3%，C和T等位基因的分布频率分别为20.2%和79.8%。112例对照组CC、CT和TT三种基因型的分布频率分别为8.9%、23.2%和67.9%，C和T等位基因的分布频率分别为20.5%和79.5%;96例冠心病组的CC、CT和TT三种基因型的分布频率分别为8.3%、22.9%和68.8%，C和T等位基因的分布频率分别为19.8%和80.2%。GPⅠbαKozak -5T/C基因多态性在冠心病组及对照组之间的分布差异无统计学意义(χ21=0.029，P1=0.986;χ22=0.036，P2=0.851)。结论 GPⅠbαKozak 序列-5T/C基因多态性与冠心病的发生未见相关性。

　　【关键词】 回族,冠状动脉粥样硬化性心脏病,血小板膜糖蛋白;基因多态性

　　冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是目前临床上常见的心血管疾病，在所有心血管病致死原因中所占比例最大。血栓形成是导致冠脉闭塞的主要病理改变。血小板膜糖蛋白GPⅠbα是血小板膜上含量最多的糖蛋白，可结合血管性血友病因子(vWF)及凝血酶。GPⅠbα基因已证实至少有3 种多态性，即 Kozak 序列-5T/C多态性、HPA-2a/2b(human platelet antigen)多态性和VNTR(variant number of tandem repeats)多态性[1]。结果证实[2-4]，GPIbα的Kozak 序列-5T/C基因多态性与冠心病、心肌梗死有关，但报道不一。本研究运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析观察该突变在回族人群冠心病患者和正常人群中的分布，并探讨其与冠心病的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 本院2007年4月—2008年3月住院行选择性冠状动脉造影患者，共208例，按照冠状动脉造影结果分为：冠心病组，共96例，男70例，女26例，平均年龄(64.97±9.39)岁，均符合WHO 关于缺血性心脏病的诊断标准。冠状动脉造影采用Judkins 法，造影结果由2 名有经验医师确定。冠状动脉造影证实左主干(LM)、左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠状动脉(RCA)中至少有1 支血管内径狭窄≥50%为阳性。对照组，共112例，男63例，女49例，平均年龄(58.63±10.82)岁，冠脉造影阴性。所有对象肝肾功能正常，来自宁夏回族人群，相互间无血缘关系。冠心病组与对照组在吸烟史、高血压、糖尿病、血清高密度脂蛋白(HDL-c)和低密度脂蛋白(LDL-c)水平差异均无统计学意义(P>0.05)，冠心病组平均年龄及男性比例大于对照组(P<0.05)。

　　1.2 方法 采集外周静脉血2mL，枸椽酸钠抗凝，低渗溶血法获得白细胞，以常规酚/氯仿抽提法提取DNA，TE 溶解后于-70℃保存。Kozak 序列-5T/C基因分型采用聚合酶链反应(PCR)，使用引物为：上游5'-GGAGATGGGAGTAGGGAGGACAG-3'，下游5'-TCAGGGTTGCCAGGGAGAAG

　　-3'(由北京奥科生物技术有限责任公司合成)。PCR 产物长度为343bp，用能识别T等位基因的限制性内切酶AvaⅡ消化，形成135bp 和208bp 的两个片断。酶切体系为20μL，包括10μL的PCR 产物，限制型内切酶AvaⅡ5U及酶切缓冲液。酶切体系在37℃水浴1h。PCR及酶切产物于2%琼脂糖电泳(溴化乙锭染色法)进行检测分型。用紫外凝胶成像系统判定结果。

　　1.3 统计学方法 数据均用SPSS 13.0 统计软件分析处理。基因型和等位基因频率等计数资料采用χ2检验，计量资料用(±s)表示，组间比较用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Kozak 序列-5T/C基因型和等位基因分布 Kozak序列-5T/C基因型的PCR 扩增片段大小为343bp，经能识别T 等位基因的限制性内切酶AvaⅡ消化，形成135bp和208bp 的两个片断。基因型判定标准如下：CC基因型(343bp)，CT基因型(135bp，208bp，343bp)，TT 基因型(135bp，208bp)。PCR 产物及酶切结果见图1。基因型和等位基因频率见表1。实验组、对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。各基因型及等位基因分布在冠心病组与对照组之间差异无统计学意义(χ21=0.029，P1=0.986;χ22=0.036，P2=0.851)。表1 实验组和对照组基因型分布和等位基因频率

　　2.2 基因型和等位基因与冠心病病变程度的关系 冠心病单支病变和多支病变组3 种基因型和等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2 基因型和等位基因频率与冠心病病变程度的关系

　　3 讨论

　　血小板膜糖蛋白GPⅠbα基因Kozak 序列-5T/C位于起始蛋氨酸密码子上游第5个碱基对处，其基因多态性可能影响血小板表面GPⅠbα的密度，-5C等位基因有较高的GPⅠbα表达水平[5]，从而可能增加血栓形成和梗死。研究表明[6-9]，GPⅠbα的基因多态性与血栓性疾病(静脉血栓、心肌梗死、中风等)有关，但结果并不一致。

　　Meisel C等[6]研究了冠心病组与对照组各1000例，其中冠心病组中269例行经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)，103例行定向旋切术，278例植入支架，联合终点是目标血管重建、心梗和死亡，随访30 d，结果发现GPⅠbα-5C等位基因携带者发生急性冠脉综合征(ACS)和PTCA术后并发症的危险显著升高。在缺血性卒中患者中也证实Kozak 序列-5T/C多态性是独立的危险因素，中风组T/C基因型明显高于对照组[7]。Afshar-kharghan V 等[2]认为，Kozak 序列-5T/C基因多态性与年轻人(<50岁)心肌梗死和冠心病有关。而Douglas 等[3]将256例行心导管检查的病人分成两组，一组经心电图或心室功能检查证实患过心肌梗死，另一组则没有心肌梗死的证据，基因型检测结果表明，GPⅠbα Kozak 序列-5T/C多态性是冠状动脉血栓形成的独立危险因素，但认为纯合子TT基因型的患者易发生心肌梗死，TC杂合子可能对心肌梗死起保护作用，并认为T/C序列多态性影响GPⅠbα-Ⅸ-Ⅴ复合物在血小板膜表面的表达，高水平的表达可能会增加血小板在受损血管局部的反应性，从而促进血栓的形成。Corral 等[4]研究发现，Kozak 序列-5T/C多态性与急性脑血管病和冠心病的发生无相关性。吕明恩等研究发现，-5C纯合子基因型频率在脑梗死组显著高于正常对照组[8]。阮宏标等使用PCR-RFLP技术检测了105例CAD和91例冠脉造影阴性的对照组，未发现Kozak -5T/C基因型和等位基因的分布在两组之间差异有统计学意义，同时也未发现Kozak -5T/C基因型和等位基因的分布在冠心病单支病变亚组和多支病变亚组之间差异有统计学意义[9]。

　　我们使用PCR-RFLP 技术检测了宁夏回族人群冠心病患者与正常人群中Kozak 序列-5T/C基因型及等位基因的分布，结果表明该基因多态性与宁夏回族人群冠心病没有相关性。此外在本研究中，与对照组相比，冠心病组年龄及男性比例显著大于对照组(P<0.05)，提示高龄和男性为冠心病的独立危险因素。本研究所选研究对象为行选择性冠状动脉造影患者，虽根据冠脉造影结果分为冠心病组与对照组，但对照组中仍包括有较多存在轻微冠脉病变而未达冠心病诊断标准的患者，从而可能造成研究对象选择上的偏倚。Kozak 序列-5T/C基因多态性与冠心病的关系仍需进一步探讨。

　　【参考文献】

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　　[4] Corral J，Lozano M1，Gonzalez-Conejero R，et al.A common polymorphism flanking the ATG initiator codon of GPⅠb alpha does not affect expression and is not a major risk factor for arterial thrombosis[J]. Thromb Haemost，2000，83：23-28.

　　[5] Afshar-Kharghan V，Li CQ，Khoshnevis-Asl M，et al.Kozak sequence polymorphism of the glycoprotein(GP)Ⅰb alpha gene is a major determinant of the plasma membrane levels of the platelet GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ complex[J]. Blood，1999，94(1)：186-191.

　　[6] Meisel C，Afshar-Kharghan，Casorbi I，et al.Role of Kozak sequence polymorphism of platelet glycoprotein Ⅰbαas a risk factor for coronaryartery disease and catheter interventions[J]. Am Coll Cardiol，2001，38：1023-1027.

　　[7] Baker RI，Eikelboom J，Lofthouse E，et al.Platelet glycoprotein ⅠbαKozak polymorphism is associated with an increased risk of ischemicstroke[J]. Blood，2001，98：36-40.

　　[8] 吕明恩，汪家敏，白霞，等.脑梗死患者血小板糖蛋白ⅠbαKozak 序列多态性研究[J]. 江苏医药杂志，2003，29(10)：781-782.

　　[9] 阮宏标，徐耕，金重赢，等.血小板膜糖蛋白Ⅰbα基因Kozak序列-5T/C多态性与冠心病的关系[J].浙江预防医学，2006，18(10)：8-10.